小米谷糠蛋白的功能性質

吳興雨，曹闊，孫凱楊，姚玥，孫豐梅, *

1. 河北北方學院食品科學系（張家口 075000）；2. 河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室（張家口 075000）；3. 河北北方學院經濟管理學院（張家口 075000）

谷子起源于黃河流域，是禾本科狗尾草屬植物，是我國重要的糧食作物之一。我國谷子的種植面積廣且產量高，谷子產量占全世界的80.0%[1]。研究表明谷子的營養價值十分豐富，其中蛋白質含量為9.28%～15.8%，碳水化合物含量約為70.0%，脂肪含量為3.8%～5.2%[2-3]。小米由谷子脫殼而成，其包含豐富的蛋白質、油脂、多糖、膳食纖維、多種維生素等人體所必需的營養物質[4-5]。小米谷糠是谷子加工成小米時所產生的麩皮、糊粉層、小米碎渣和小米胚芽等副產物。研究顯示谷糠中包含蛋白質、脂肪、多糖、膳食纖維、維生素、礦物元素、硫胺素、核黃素、尼克酸及多種不飽和脂肪酸等營養成分[6]。

蛋白質在食品加工中的應用不僅依賴于營養性，功能性質也很重要。例如在多油食品中加入蛋白質可使口感變得清爽；在烘焙食品中加入蛋白質可保留一定水分，使其變得軟嫩并保持其風味[7]。蛋白質的功能性質是指使食品出現人們所期望的特征作出貢獻的蛋白質物理性質。蛋白質的功能性質主要分為3類：蛋白質的水合性質、蛋白質的凝膠性、蛋白質的表面性質。其中蛋白質的水合性質主要是分散性、溶解性、吸水性、吸油性、持水性等，表面性質主要是起泡性和乳化性[3]。對小米谷糠蛋白的起泡性、乳化性、溶解性研究較少，但對小米谷糠蛋白的抗肝損傷和抑制腫瘤效果有肯定意義的研究。許潔[8]建立CCl4和過量酒精對小鼠肝損傷的模型，用添加高劑量小米谷糠清蛋白的飼料喂養，通過切片觀察，證明了小米谷糠清蛋白對肝損傷具有抑制作用。于書佳等[9]利用氨基比林-NaNO2誘導小鼠發生肝損傷及前期癌變，用菠蘿蛋白酶水解提取的小米谷糠蛋白添加到小鼠的飼料中，試驗表明在添加量為10 g/（kg·d）時，其對小鼠的肝損傷及前期癌變有抑制作用，證明小米谷糠蛋白在保健品和抗腫瘤藥品方面的開發潛力。

試驗旨在研究小米谷糠蛋白的營養組成和功能性質分析，為小米谷糠蛋白在食品工業中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米谷糠（張雜谷13號，河北巡天農業科技有限公司）；堿性蛋白酶（北京奧博星生物技術有限公司）；G250-考馬斯亮藍（北京亞米生物科技有限公司）；牛血清蛋白（北京博爾西科技有限公司）；G-100葡聚糖凝膠（4～150 kDa，北京北納創聯生物技術研究院商城分院）；無水乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）；鹽酸（北京化工廠）；氫氧化鈉（天津市永大化學試劑有限公司）；磷酸（上海譜振生物科技有限公司）；正己烷（天津市科密歐化學試劑有限公司）；氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂（濰坊坤陽化工有限公司）。化學試劑純度均為分析純。

1.2 儀器與設備

BCD-249CF美菱電冰箱（合肥美菱股份有限公司）；79-1磁力加熱攪拌器（常州澳華儀器有限公司）；JA-1003N電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；HH-S數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）；JYL-C50T九陽料理機（九陽股份有限公司）；HC-3018高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（上海佑科儀表有限公司）；A-25高速分散器（上海喬榮電子科技有限公司）；UV-76紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；BDF86V158低溫冷凍箱（濟南來寶醫療器械有限公司）；GZLYZ真空冷凍干燥機（北京松源華興生物科技有限公司）；NB-100D超聲器（鄭州南北儀器設備有限公司）；5 kDa 15 mL內管×50 mL外管超濾離心管（密理博中國有限公司）；50 mm×500 mm凝膠柱/四氟活塞標準口（北京北納創聯生物技術研究院商城分院）。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米谷糠基本成分測定

小米谷糠中的水分、蛋白質、灰分、油脂和淀粉含量測定分別參考GB 5009.3—2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》[10]、GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[11]、GB/T 5009.4—2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[12]、GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》[13]和GB/T 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》[14]。

1.3.2 谷糠蛋白制備及純化

使用料理機粉碎小米谷糠，過40目篩，在85 ℃恒溫干燥箱中干燥4 h。加入5倍正己烷浸泡，干燥后樣品，密封后在35 ℃恒溫箱中放置12 h，后倒掉上層溶劑，重復操作2次。自然干燥后即得脫脂小米谷糠。

稱取20 g小米谷糠，加入200 mL蒸餾水，放入超聲波清洗器中超聲30 min，加速蛋白質溶出[7]。再加入堿性蛋白酶，在60 ℃、pH 10的條件下水浴3 h，100 ℃滅酶，冷卻至室溫，以4 000 r/min離心15 min，取沉淀物真空干燥即為谷糠蛋白。

由于提取液的量較大，故采用超濾管進行脫鹽以濃縮蛋白質[15]。取20 mL溶液置于超濾離心管中，轉速為2 000 r/min，離心15 min。

采用葡聚糖凝膠柱進行蛋白質純化，參考文獻[19]的方法制備葡聚糖凝膠柱。加入100 mL蛋白液后進行恒流洗脫。每5 min收集1次洗脫液，并用考馬斯亮藍法測定洗脫液是否含有蛋白質，若無則停止洗脫。

將上述洗脫液進行收集，調制等電點，過濾收集沉淀，于-40 ℃冷凍沉淀物12 h，在低溫冷凍干燥機干燥48 h，得到純化后小米谷糠蛋白樣品，用凱氏定氮法測定蛋白純度。

1.3.3 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定提取液中蛋白質的含量，具體操作方法參照SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質含量的測定-考馬斯亮藍法》[16]。

1.3.4 氨基酸分析

委托內蒙古農牧漁業生物實驗中心進行小米谷糠蛋白的氨基酸組分分析。

1.3.5 等電點測定

取1 g制備的小米谷糠蛋白樣品溶解于5 mL超純水中，調節溶液酸堿度pH 7，過濾，以4 000 r/min離心10 min后取上清液，用0.1 mol/L鹽酸調pH至沉淀量最大，此時pH即為小米谷糠蛋白的等電點。

1.3.6 功能性質測定

將小米谷糠蛋白與PBS磷酸緩沖液配制成質量分數為5%分散系，調節溶液酸堿度梯度pH 3，4，5，6，7，8，9和10，于25 ℃攪拌1 h，以2 000 r/min離心20 min[15]，用考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質含量。蛋白質的溶解度按式（1）計算。

金屬離子對小米谷糠蛋白溶解性的影響。分別配制1 L NaCl、MgCl2、CaCl2溶液，濃度分別為0.1，0.8和1.2 mol/L。加入1 g小米谷糠蛋白，調節pH 2，3，4，5，6，7，8，9和10，離心速度2 000 r/min，離心半徑20 cm，離心20 min。用考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質含量。

小米谷糠蛋白起泡性及穩定性測定。分別配制1，3，5，7和9 g/mL小米谷糠蛋白懸浮液，取25 mL溶液，用高速分散器10 000 r/min攪拌3 min，記錄攪打后的總體積和泡沫體積。隨后靜置樣品10 min，記錄泡沫體積。起泡性及穩定性按式（2）和（3）計算。

小米谷糠蛋白乳化性及穩定性測定。配制30 mL 1，3，5和7 g/100 mL不同質量濃度梯度的小米谷糠蛋白懸浮液，用高速分散器10 000 r/min攪打30 s，加入5 mL花生油，攪打30 s，加入5 mL花生油，攪打90 s，攪打完成后測定此時的乳濁液體積。將乳濁液在2 000 r/min離心5 min，測量此時乳化層的體積。將離心后的混合液在85 ℃水浴鍋中加熱15 min，冷卻后在2 000 r/min轉速下離心5 min，測定此時的乳化層體積。乳化力和乳化穩定性按式（4）和（5）計算。

2 試驗結果

2.1 小米谷糠基本成分測定

經測定，小米谷糠中蛋白質、油脂、水分、淀粉、灰分含量分別為8.69%，2.41%，12.37%，27.55%和6.75%。

2.2 考馬斯亮藍標準曲線

分別配制系列濃度梯度的牛血清蛋白質量，得到的標準曲線為y=5.397 7x-0.809 7，R2=0.990 2，如圖1所示。

圖1 考馬斯亮藍牛血清蛋白標準曲線

2.3 小米谷糠蛋白純度

采用超濾管濃縮法可得到濃縮率70%樣品。經葡聚糖凝膠柱純化后樣品純度為82.61%。許潔[8]采用超濾膜技術提純蛋白質，提純后的蛋白質純度為73.61%，試驗提純蛋白質采用凝膠層析法提純，提純后的純度為82.61%，初步證明凝膠層析法提純蛋白質優于超濾膜技術。

2.4 氨基酸測定

谷糠清蛋白氨基酸測定結果見表1。含量最高的是谷氨酸，最低的是色氨酸，從測定結果來看，必需氨基酸種類齊全。小米谷糠清蛋白中含有8種必需氨基酸，達到全價蛋白的標準，且必需氨基酸占到氨基酸總量的36.3%，除苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的（ASS）值＜100以外，其他必需氨基酸的ASS值＞100。小米谷糠清蛋白中8種必需氨基酸的含量接近聯合食品標準計劃（FAO/WHO）推薦的標準模式。小米谷糠中的組氨酸含量為205，大于（FAO/WHO）推薦的170，并且有低致敏性，非常適合作為嬰幼兒的蛋白營養補劑，可作為嬰幼兒奶粉或保健食品的蛋白質類補充劑。小米谷糠清蛋白中蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量約22.1%，這類氨基酸具有減脂增肌的作用，可作為運動員的營養補劑。組氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸具有抗氧化活性的氨基酸占20%左右，這類氨基酸能夠促進蛋白質與氨基酸的代謝。小米谷糠清蛋白氨基酸種類齊全，營養價值比較高，具有十分廣闊的應用前景。

表1 小米谷糠清蛋白氨基酸分析結果

表2 小米谷糠蛋白中必需氨基酸營養價值評定mg/100 g

2.5 小米谷糠蛋白溶解性分析

小米谷糠蛋白的溶解度隨溶液pH的變化曲線如圖2所示。pH 4～6時，溶解度較低，說明越接近蛋白質的等電點，溶解度越低。pH＜4或pH＞5時，蛋白質分子所帶的電荷沒有達到平衡的狀態，水合性質增強，蛋白質溶解度隨之增加。在強酸或強堿的溶液中蛋白質發生解離，溶解性隨之升高，但此時溶解度已是分子解離后蛋白質濃度。

2.6 金屬離子對小米谷糠蛋白溶解性的影響

不同濃度鹽溶液對小米谷糠清蛋白溶解度見圖3。谷糠蛋白分別溶解在0.1 mol/L的Na+、Mg2+、Ca+溶液中，在相同pH下，Na+對谷糠蛋白的溶解性比Mg+、Ca+影響要小，即在0.1 mol/L的Na+溶液中溶解性高于同等濃度的Mg+、Ca+溶液。整體來看，不論是哪一種金屬離子，pH接近等電點時，蛋白的溶解性均較差。pH偏離等電點時，蛋白質的溶解性升高，尤其是在堿性環境下，隨著pH升高，蛋白質的溶解性快速提升。離子濃度為0.8 mol/L時，其對谷糠蛋白溶解性的影響總體趨勢與離子濃度0.1 mol/L時一致，但無論是哪一種金屬離子，在相同pH下，谷糖蛋白的溶解性均小于濃度為0.1 mol/L時，說明鹽離子濃度增大能夠降低谷糠蛋白在水中的溶解性。

圖2 pH對小米谷糠清蛋白溶解性影響

圖3 不同濃度鹽溶液對小米谷糠清蛋白溶解性影響

2.7 小米谷糠蛋白起泡性和起泡穩定性分析

由圖4可知，蛋白質的質量分數5%時，起泡力達到最大，為193%。隨著蛋白質質量濃度的增加，起泡性反而降低。可能是由于小米谷糠蛋白質量分數增加，使溶液黏度過高，影響了起泡的產生。隨著小米谷糠清蛋白質量分數的增加，起泡穩定性液隨之增加。起泡穩定性呈現一直增加的趨勢，但試驗中小米谷糠蛋白質量分數取值可能沒有達到起泡穩定性的最大值。小米谷糠蛋白的起泡力和起泡穩定性與蛋白質的濃度密切相關，這是因為隨著蛋白質質量濃度的升高，黏度也會隨之升高，會更加容易形成水膜，但黏度過高，則不容易形成水泡。起泡穩定性主要和攪打后形成的水膜穩定性有關，蛋白質濃度升高時，溶液的黏度增大，水膜形成的穩定性更好，不容易破裂。蛋白質質量分數5%時達到最大值之后，隨著蛋白質質量分數的升高，黏度升高，起泡力降低。起泡穩定性則隨著蛋白質濃度升高而升高。在食品工業中最常使用的蛋白是大豆蛋白，計曉曼等[20]研究發現堿性蛋白酶改性后大豆蛋白的起泡能力為217.50%，泡沫穩定性為93.10%。試驗研究得到的谷糠蛋白的最優起泡能力和起泡穩定性結果為193%和73%。此功能性質比之大豆蛋白略低，但也可應用于食品工業，如可在糖霜和烘焙食品中作為發泡劑使用。

圖4 小米谷糠清蛋白濃度對起泡力和泡沫穩定性的影響

2.8 小米谷糠谷蛋白乳化性及乳化穩定性分析

乳化性是蛋白質重要的加工功能特性之一，蛋白質的乳化特性的存在是由于其內部存在著親油和親水基團，乳化穩定性也與蛋白質中的親水和親油基團相關[20]。由圖5可得，蛋白質質量分數在5%時，乳化力為51.3%，在此之前，乳化力穩定性隨之升高；蛋白質質量分數在5%之后，乳化力變化不明顯。考慮到成本和產量情況，小米谷糠蛋白在實際中的應用應選取質量分數5%作為適宜乳化濃度。隨著蛋白質濃度升高，乳化穩定性也隨之增高，但增高的趨勢趨于平緩。小米谷糠蛋白的濃度升高對乳化穩定性有促進作用，但促進效果越來越小。王喜波[21]研究發現均質后的大豆蛋白乳化性為50.3%，和小米谷糠蛋白基本一致，說明在乳化性方面小米谷糠蛋白具有和大豆蛋白相同的應用價值，如可以在肉制品中作乳化劑使用，在高湯內作乳化劑和增稠劑使用。

圖5 小米谷糠清蛋白濃度對乳化力和乳化穩定性影響

3 結論

小米谷糠蛋白具有巨大的利用價值，若能夠成功利用并且投入生產，不僅是一筆巨大財富，更能減少資源浪費，貫徹可持續發展觀。試驗對小米谷糠蛋白的一些組成成分進行分析，結果顯示：小米谷糠中蛋白質、油脂、水分、淀粉、灰分含量分別為8.69%，2.41%，12.37%，27.55%和6.75%。選用超濾管離心和凝膠層析法純化谷糠清蛋白，經測定小米谷糠清蛋白的純度為82.61%，對比其他文獻的試驗結果，此方法得到的蛋白質純度比較理想。小米谷糠清蛋白經氨基酸分析測定，其中必需氨基酸含量占到氨基酸總量的36.3%，除苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量稍微低于FAO/WTO推薦值外，其他必需氨基酸都符合標準，組氨酸是嬰幼兒所必需的氨基酸，其AAS值為205，大于（FAO/WHO）推薦的170。通過等電點沉淀法得出小米谷糠蛋白的等電點為pH 4.4，小米谷糠蛋白的溶解性、起泡性和乳化性良好，適用于食品工業中。