反復(fù)凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白

張安寧，王曄，李照晴，孫麗慧*

大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（盤(pán)錦 124221）

米糠是稻谷加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，通常占稻谷質(zhì)量的6%～8%，卻含有占稻谷約60%的營(yíng)養(yǎng)成份及90%的人體所需營(yíng)養(yǎng)素，有“天然營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”之稱[1]。米糠中包含11%～16%[2]粗蛋白，米糠蛋白與大豆蛋白接近，其氨基酸組成符合FAO/WHO推薦營(yíng)養(yǎng)模式[3-4]，蛋白消化率達(dá)90%以上且過(guò)敏性低，因而在嬰幼兒配方食品中有著廣泛應(yīng)用[5]。

米糠蛋白的提取方法主要包括強(qiáng)堿法、酶法和物理法[6-7]。酶法提取，可以保持較好的蛋白營(yíng)養(yǎng)性和功能性，例如王曉雅等[8]利用堿性蛋白酶，在溫度60℃，pH 9.5條件下提取3 h，可獲得米糠的蛋白的提取率為75.42%，但酶的成本較高，后處理繁瑣，該方法還適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；物理方法簡(jiǎn)單方便，但提取效率偏低，常被用作米糠蛋白提取的輔助方法，如于雷等[9]利用超聲輔助雙酶法提取米糠蛋白，在功率220 W條件下超聲20 min，用α-淀粉酶和蛋白酶進(jìn)行酶解，在最優(yōu)條件下米糠蛋白的提取率可達(dá)80.83%；堿提取法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，且提取率高，如Chen等[10]在溫度25 ℃，pH 12條件下提取1 h，米糠蛋白提取率為82.50%，然而在強(qiáng)堿條件下蛋白變性程度高，而且還會(huì)加速美拉德反應(yīng)，影響蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

反復(fù)凍融是一種較溫和的破壁方式，主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和殘余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，如此反復(fù)達(dá)到破壁的目的。試驗(yàn)采取反復(fù)凍融輔助弱堿法（在pH 9.5條件下）提取米糠蛋白，并對(duì)其功能特性進(jìn)行分析，為米糠蛋白進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠（遼寧恒際生物科技有限公司）；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker、牛血清白蛋白（生工生物工程（上海）股份有限公司）；其他化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-5800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；KDN-04C凱氏定氮儀（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；FD-1C-50真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DYY-8C型電泳儀及DYCZ-24DN電泳槽（北京六一儀器廠）；Zeta sizer Nano ZS-納米粒度與ZETA電位分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白的制備

新鮮米糠通過(guò)80目篩子剔除雜質(zhì)，使用正己烷按料液比1︰10（g/mL）脫脂。脫脂米糠使用弱堿（氫氧化鈉溶液，pH 9.5）按料液比1︰10～1︰25（g/mL）浸泡，并將其放入-20 ℃環(huán)境下進(jìn)行冷凍4 h，于45℃條件下解凍，反復(fù)凍融1～6次，每次凍融后都使用0.1 mol/L濃度的NaOH或HCl調(diào)節(jié)料液pH，使其維持在9.5；處理好的料液于35～50 ℃條件下進(jìn)行堿提1～3 h（pH 9.5），邊提取邊攪拌，以4 500 r/min離心20 min分別得殘?jiān)蜕锨逡海瑲堅(jiān)?次后離心，合并上清液；上清液調(diào)至pH 4.5進(jìn)行酸沉，以4 500 r/min離心20 min，對(duì)蛋白沉淀收集并進(jìn)行真空冷凍干燥回收得到米糠蛋白。

1.3.2 提取工藝的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

分別以凍融次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以米糠蛋白提取率為衡量指標(biāo)，具體方案如表1。

表1 蛋白提取條件的單因素試驗(yàn)

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出反復(fù)凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白的最優(yōu)條件。

表2 正交試驗(yàn)的因素與水平

1.3.3 分析測(cè)定方法

1.3.3.1 蛋白含量測(cè)定

使用采用凱氏定氮法測(cè)定脫脂米糠中粗蛋白含量及所提取的米糠蛋白產(chǎn)品純度，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液中米糠蛋白含量，提取率按式（1）計(jì)算。

1.3.3.2 米糠蛋白的性質(zhì)

1) 持水性和持油性

米糠蛋白用去離子水/大豆油稀釋到10 mg/mL并充分混合，于5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min，小心移除上清液。持水/油性（WHC/OHC）按式（2）計(jì)算[11]。

2) 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

使用去離子水配制100 mL 1 g/100 mL米糠蛋白溶液，用高速分散均質(zhì)機(jī)在1 000 r/min均質(zhì)2 min，迅速倒入量筒記錄泡沫體積V1，靜置30 min后，再次測(cè)量泡沫體積V2，起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）按式（3）和（4）計(jì)算[12]。

3) 乳化性及其穩(wěn)定性

使用0.05 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液中配制1 g/100 mL米糠蛋白溶液，取75 mL蛋白溶液與25 mL大豆油充分混合，在乳化機(jī)10 000 r/min轉(zhuǎn)速下乳化2 min后立刻從燒杯底部吸取20 μL乳狀液，加入5 mL 0.1% SDS溶液混合。以濃度為0.1% SDS溶液為空白樣品，測(cè)定500 nm下的吸光度。待乳化液放置10 min后，從燒杯底部吸取乳狀液（與0 min取樣點(diǎn)位置相同），按上述方法測(cè)定吸光度[13]。乳化活性EAI和乳化穩(wěn)定性ES按式（5）和（6）計(jì)算。

式中：T=2.303；N為稀釋倍數(shù)，250；c為乳化液未形成前蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度，g/mL；Φ為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)，0.25；A0和A10分別為0和10 min時(shí)吸光度；t為間隔時(shí)間，10 min。

4) 蛋白溶解度

稱取0.1 g米糠蛋白樣品加入到10 mL去離子水中，將pH分別調(diào)至2～11，室溫下磁力攪拌1 h，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，收集上清液，測(cè)其蛋白含量，蛋白溶解度按如式（7）計(jì)算[14]。

5) 米糠蛋白Zeta電位滴定曲線

使用去離子水配制2 mg/mL米糠蛋白溶液，采用0.5 mol/L NaOH或0.5 mol/L HCl在持續(xù)攪拌條件下滴定蛋白溶液，使其從pH 10.0逐漸降低至pH 2.0，測(cè)定不同pH下蛋白微粒Zeta電位。比色池采用規(guī)格為1 cm的聚苯乙烯池，采用一對(duì)0.45 cm2鉑電極，間距為0.4 cm。測(cè)定溫度為25 ℃，溫度平衡時(shí)間2 min[15]。

6) 米糠蛋白亞基分布及其相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

米糠蛋白亞基分布及其相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法。稱取10 mg米糠蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，沸水浴加熱5 min。分離膠與濃縮膠濃度分別為15%和5%，上樣量10 μL。染色采用0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液，脫色采用高甲醇的醋酸溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠蛋白的制備

圖1所示，對(duì)試驗(yàn)中反復(fù)凍融次數(shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為凍融4次、料液比1︰15（g/mL）、提取時(shí)間120 min、提取溫度45 ℃。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以米糠蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)選出反復(fù)凍融輔助弱堿法的最佳提取條件，結(jié)果如表3。根據(jù)極差分析可知影響提取率的主次因素為凍融次數(shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比，最佳提取條件為A2B2C3D2，即凍融4次、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間150 min、料液比1︰15（g/mL）。

在最優(yōu)條件下使用反復(fù)凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白，結(jié)果如圖2所示。使用反復(fù)凍融輔助弱堿法制備米糠蛋白提取率和純度分別為63.07%和66.61%，與等同條件下只采用弱堿法制備米糠蛋白相比，提取率提高11.49%，而蛋白純度基本沒(méi)有明顯改變。

2.2 米糠蛋白的性質(zhì)測(cè)定

2.2.1 持水性和持油性

蛋白產(chǎn)品應(yīng)用在食品配方中時(shí)一般都要求具有高持水性和高持油性，如在蛋糕、香腸等加工食品。如圖3所示，與單獨(dú)使用弱堿法提取米糠蛋白相比，凍融輔助弱堿提取蛋白的持水性略有降低，而持油性基本沒(méi)有改變。Aletor等[16]認(rèn)為，蛋白持水性在1.49～4.72 g/g范圍內(nèi)，可應(yīng)用于各種黏性食品中。試驗(yàn)采用凍融輔助弱堿提取的米糠蛋白的持水性為3.58 g/g，表明其仍具有較好持水性。

2.2.2 泡沫特性

蛋白泡沫特性反映其降低水-空氣界面表面張力的能力，這與蛋白分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，且在食品工業(yè)中形成泡沫可以增加產(chǎn)品的體積。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，蛋白樣品的泡沫特性并無(wú)區(qū)別，表明反復(fù)凍融輔助弱堿提取米糠蛋白并未對(duì)其發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響。

圖1 不同因素對(duì)米糠蛋白提取率的影響

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取方式對(duì)米糠蛋白提取率和純度影響

圖3 提取方式對(duì)米糠蛋白持水/油性的影響（WHC持水性；OHC持油性）

圖4 提取方式對(duì)米糠蛋白持水/油性和泡沫特性的影響（FC起泡性；FS泡沫穩(wěn)定性）

2.2.3 乳化特性

乳液的形成是由于蛋白結(jié)構(gòu)中存在著一些疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，蛋白的乳化特性是其在食品工業(yè)中用作表面活性劑的一個(gè)重要參考，而牛血清白蛋白（BSA）則常被用作比較蛋白乳化性能的參考標(biāo)準(zhǔn)[17]。從圖5可以看出，與單獨(dú)使用弱堿提取米糠蛋白相比，凍融輔助弱堿法提取蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性并無(wú)明顯差異。與BSA相比，2種方式提取的米糠蛋白樣品均有著較好的乳化穩(wěn)定性，但乳化性則差于BSA。

圖5 提取方式對(duì)米糠蛋白乳化性及其穩(wěn)定性的影響（EAI乳化性；ES乳化穩(wěn)定性）

2.2.4 蛋白溶解度及Zeta電位滴定曲線

如圖6所示，2種方式提取的米糠蛋白樣品表現(xiàn)出相同的蛋白溶解曲線，即曲線的形狀類似于“U”形，在pH 4～5（等電點(diǎn)附近）溶解度最低，pH低于4或高于5時(shí)，蛋白溶解度緩慢提高，但pH大于10時(shí)，溶解度又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能與高濃度堿性條件下蛋白的變性有關(guān)。

Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位，是表征蛋白在溶液中的穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[18]。從圖7中可以看出，2種方式提取的米糠蛋白樣品Zeta電位滴定曲線并無(wú)明顯區(qū)別。單獨(dú)使用弱堿提取的米糠蛋白在pH 4.36時(shí)Zeta電勢(shì)為0，為其等電點(diǎn)；使用凍融輔助弱堿提取的米糠蛋白在pH 4.31時(shí)Zeta電勢(shì)為0，為其等電點(diǎn)。蛋白在等電點(diǎn)溶解度最低，試驗(yàn)結(jié)果與圖5中米糠蛋白溶解度的變化一致。

圖6 不同方式提取的米糠蛋白溶解度

圖7 不同方式提取的米糠蛋白Zeta電位滴定曲線

2.2.5 蛋白亞基分布及其相對(duì)分子質(zhì)量

圖8 不同方式提取的米糠蛋白SDS-PAGE圖

SDS-PAGE凝膠電泳常被用來(lái)研究蛋白中亞基的分布變化及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定[19]。對(duì)米糠蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白亞基分布如圖8所示。可以看出，2種不同提取方式得到的米糠蛋白電泳圖譜并無(wú)明顯區(qū)別，可見(jiàn)反復(fù)凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白對(duì)其亞基分布及其相對(duì)分子質(zhì)量基本沒(méi)有影響。這2個(gè)蛋白樣品的亞基相對(duì)分子質(zhì)量分布主要分為3個(gè)區(qū)域，即42.7～66.2 kDa；31.0～42.7 kDa和＜31.0 kDa。

3 結(jié)論

以米糠為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)反復(fù)凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最優(yōu)條件為：反復(fù)凍融4次、料液比1︰15（g/mL）、提取溫度45 ℃及提取時(shí)間150 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，蛋白的提取率為63.07%，純度為66.61%。該方法制備的米糠蛋白的特性良好，其蛋白泡沫特性、持油性、乳化穩(wěn)定性、溶解度、Zeta電位滴定曲線及蛋白亞基相對(duì)分子質(zhì)量分布與單獨(dú)利用弱堿法提取的米糠蛋白樣品對(duì)比并無(wú)明顯差異，而持水性略有降低。研究表明凍融輔助弱堿提取米糠蛋白能明顯提高提取率，且該方法操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜或昂貴的設(shè)備，是一種切實(shí)可行的米糠蛋白提取方法。