超高壓殺菌工藝對生牛乳中微生物的影響

馬莉，張杰，任憲峰，鄭利君，俞偉祖*

內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司（呼和浩特 011517）

牛乳是一種富含蛋白質、礦物質等多種人體所需的營養(yǎng)成分及免疫活性因子的食品[1-5]，為了保證食品安全性，天然牛乳必須經過殺菌[6-11]。傳統(tǒng)的熱力殺菌雖然大大提高了產品的貨架期和食品安全性，但對牛乳的營養(yǎng)成分和風味物質破壞相當嚴重[12]，直接影響了產品的質量[13-15]。然而，消費者對優(yōu)質食品的要求是新鮮、美味、營養(yǎng)，這使得非熱加工技術越來越受到食品工業(yè)的關注[16]。超高壓殺菌技術作為一種新型非熱加工技術，不但可以達到熱力殺菌同樣的效果[17-18]，而且可以最大限度地保留牛乳的天然色澤、香氣成分與營養(yǎng)價值[19-20]，同時還能夠增強牛乳蛋白的可消化性。試驗以超高壓處理壓力、保壓時間為因素，菌落總數(shù)及大腸菌群數(shù)量為指標，研究了超高壓處理工藝對生牛乳中微生物的影響，初步確定生牛乳超高壓殺菌的工藝條件，為超高壓技術在牛乳殺菌中的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳：內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司；BGLB肉湯培養(yǎng)基、PCA平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術有限責任公司）；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HPP600MPa-30L超高壓設備（包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司）；LVG-3_G-F8超凈工作臺（新加坡Esco科技有限公司）；VORTEX1渦旋振蕩儀（艾卡儀器設備有限公司）；NP-30S旋渦混合器（常州恩培儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 超高壓處理工藝

1.3.1.1 超高壓處理壓力對生牛乳中微生物的影響

固定溫度25 ℃、保壓時間15 min，壓力分別選取100，150，200，300，350，400，500和600 MPa處理生牛乳，以未經超高壓處理的鮮牛乳作為空白對照組，檢測處理前后樣品中的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量。

1.3.1.2 保壓時間對牛乳中微生物的影響

固定壓力400 MPa、溫度25 ℃，采用不同保壓時間5，10，15，20，30和40 min處理生牛乳，空白對照組為未經超高壓處理的生牛乳，檢測處理前后樣品的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量。

1.3.1.3 超高壓處理工藝條件優(yōu)化

在超高壓處理壓力和保壓時間單因素試驗的基礎上，優(yōu)選出最佳處理壓力和保壓時間，進行正交試驗，以未經超高壓處理的生牛乳作為空白對照組，對超高壓處理后的樣品進行菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量的測定，篩選微生物致死率較高的壓力、時間組合。

1.3.2 微生物的檢測

按照GB/T 4789.2—2003和GB/T 4789.3—2003測定。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理壓力對生牛乳中微生物的影響

在保壓時間15 min、溫度25 ℃條件下，對生牛乳進行不同壓力的滅菌，每個處理重復3次，取平均值。處理壓力對生牛乳中菌落總數(shù)的影響如圖1和表1所示。在低壓處理條件（100～300 MPa）下，菌落總數(shù)相比鮮牛乳中的初始菌數(shù)（1.2×105CFU/mL）有所增加，致死率為負數(shù)。隨著壓力的增加，菌落總數(shù)呈顯著下降趨勢，當壓力達到400 MPa時，殘留菌數(shù)為7.4×103CFU/mL，致死率達93.8%；當壓力達到500 MPa時，殘留菌數(shù)為4.7×103CFU/mL，致死率達96.1%；當壓力達到600 MPa時，殘留菌數(shù)為1.5×103CFU/mL，致死率達98.8%。生牛乳中的大腸菌群隨著壓力的增加一直呈顯著下降趨勢，當壓力為150 MPa時，大腸菌群數(shù)由初始的4.5×103CFU/100 mL降低至＜1 CFU/100 mL，大腸菌群呈陰性。綜合超高壓設備的使用壽命及殺菌效率，在殺菌效率達到96%以上的情況下選擇壓力進行保壓時間單因素試驗。因此，選擇進行保壓時間單因素試驗的處理壓力為500 MPa。

圖1 不同壓力處理生牛乳15 min后對殘留的菌落總數(shù)的影響

表1 不同壓力處理生牛乳15 min后微生物的結果

2.2 保壓時間對生牛乳中微生物的影響

在處理壓力500 MPa、溫度25 ℃的條件下，對鮮牛乳進行不同保壓時間的超高壓處理，每個處理重復3次，取平均值。保壓時間對菌落總數(shù)的影響見圖2和表2。由圖2可知，在處理壓力500 MPa下，隨著保壓時間的延長，殺菌效率呈顯著性提高，當保壓時間達到20 min以后，殺菌效率的增長速率下降，趨于緩慢提高，說明當殺菌效率達到一定值后，僅通過保壓時間的延長不能達到完全殺滅細菌的目的。但對于大腸菌群而言，在500 MPa壓力下保壓5 min即可被完全殺滅。

圖2 500 MPa壓力下處理生牛乳不同時間對殘留菌落總數(shù)的影響

表2 500 MPa壓力下處理生牛乳不同時間后微生物的結果

2.3 超高壓處理工藝條件優(yōu)化

綜合上述壓力和時間的單因素試驗，選擇兩者作為影響因素，同時由于低壓力有利于鮮牛乳中芽孢的激活，而高壓力有利于細菌的殺滅，因此將低壓力、低壓保壓時間、高壓力和高壓保壓時間作為超高壓殺菌效率的影響因素，選用L9(34)正交表進行試驗設計，每個處理重復3次，取平均值，以未經超高壓處理的樣品作為空白對照，經超高壓處理后的樣品進行菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量的測定。因素水平設置見表3，結果及方差分析見表4和表5。

表3 L9(34)因素水平表

表4 超高壓殺菌乳最優(yōu)工藝參數(shù)正交試驗結果

表5 正交試驗菌落總數(shù)結果方差分析

由表4中菌落總數(shù)的相關數(shù)據(jù)，分析k值可知，最優(yōu)工藝組合為A3B1C3D2，即低壓200 MPa，低壓保壓時間5 min，高壓500 MPa，高壓保壓時間30 min。分析R值可知，4個因素對微生物殺滅作用影響的大小依次為高壓＞高壓保壓時間＞低壓＞低壓保壓時間，且高壓、高壓保壓時間這2個因素對于超高壓殺滅微生物的效果有顯著性影響。在此最優(yōu)工藝組合條件下對生牛乳進行超高壓滅菌，菌落總數(shù)由處理前的1.2×105CFU/mL降低到處理后的100 CFU/mL，致死率達到99.92%，此時大腸菌群被全部殺滅。

3 結論

單因素試驗中，處理壓力在一定范圍內，隨著壓力的增大，菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量的致死率呈上升趨勢，但當壓力超過一定范圍后，處理壓力的繼續(xù)增加對殺菌效果的影響趨于平緩，趨勢不顯著；保壓時間也影響超高壓對鮮牛乳中微生物的殺滅效果，延長保壓時間，菌落總數(shù)和大腸菌群的致死率呈顯著上升趨勢，但當時間超過一定范圍后，對滅菌效率的影響趨于平緩，呈不顯著上升趨勢。

超高壓殺菌工藝的正交優(yōu)化條件為A3B1C3D2，即低壓200 MPa，低壓保壓時間5 min，高壓500 MPa，高壓保壓時間30 min。

綜上所述，研究采用超高壓殺菌技術殺滅生牛乳中的微生物，處理后的牛乳中菌落總數(shù)和大腸菌群殘留量很少，殺菌效果較好，但僅優(yōu)化壓力和時間兩個參數(shù)，不能使最終殺菌效果達到商業(yè)無菌的要求，因此在后續(xù)的研究中需要對超高壓殺菌的其他參數(shù)比如溫度進行進一步研究，綜合考量各參數(shù)的最優(yōu)指標及組合，為鮮奶產品的生產提供參考。