影響葉黃素穩定性的因素

李秀鑫，吳紅艷*，于曉丹，翟麗萍

1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）；2. 山東星光糖業有限公司（德州 253000）

葉黃素屬于一種存在于天然環境中的無維生素A活性的類胡蘿卜素[1-2]，是一種含有兩個不同紫羅酮環的天然黃體素，是存在于人體視網膜黃斑區的主要色素[3-5]。在自然界中的各類果蔬、花卉中均有大量存在。可作為天然著色劑用于各行業生產，并由于其具有寶貴的生物活性，抗氧化性，可作為營養強化劑使用，對預防和治療老年性黃斑退化綜合癥、心血管疾病和機體免疫力等疾病方面有明顯功效[6-8]。葉黃素現已在各類健康產業中占據重要地位，是一種不可或缺的組成。

國內外對于葉黃素的生產與應用均已得到一定成果，如申雪然等[9]研究葉黃素在嬰幼兒配方乳粉生產過程和貨架期的損失率，分析影響葉黃素穩定性的各項因素。趙永平等[10]研究超臨界CO2法萃取萬壽菊中葉黃素的最佳工藝條件，萃取量最高可達0.436 mg/g。但在葉黃素的提取及應用過程中，需要不同工藝手段進行操作收集，可能會出現提取率較高，但是保存條件較差，致使葉黃素凈得率與應用率反而低于其他工藝條件，不能達到預期效果。試驗旨在探索葉黃素最佳保存條件，為葉黃素的保存與制備提供便利，對葉黃素的生產與應用領域提供理論基礎與數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料、試劑

葉黃素標準品（上海源葉生物有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市天力化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器和設備

BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；DL-360E智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；SHZ-C水浴恒溫振蕩器（上海躍進醫療器械廠）；PB-10型酸度計（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；722S型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 波長的選擇

準確稱取10 mg葉黃素標準品，用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用超聲使其進行更好溶解，利用分光光度計在400～600 nm處測其吸光度[11]，以波長為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制其葉黃素吸收光譜曲線，測定其最大吸收波長。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取3.33 mg葉黃素標準品，用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用超聲使其更好的互溶，配制成0.033 mg/mL的乙醇-葉黃素標準溶液，從其中分別吸取1.25，2.50，5.00，7.50和10.00 mL標準溶液，并用無水乙醇定容至25 mL棕色容量瓶中，其葉黃素的梯度質量濃度為0.001 65，0.003 30，0.004 95，0.006 60和0.008 25 mg/mL。在其最大吸收峰處測其吸光度，繪制其葉黃素-乙醇標準曲線。

1.3.3 葉黃素穩定性的研究

準確稱取10 mg葉黃素標準品溶于3 000 mL無水乙醇中，研究溫度、加熱時間及pH在其最大吸收波長處對葉黃素穩定性的影響，并進行正交試驗。

式中：n為葉黃素含量，mg；C為葉黃素質量濃度，mg/mL；V為葉黃素-乙醇溶液體積，mL。

式中：A1為在不同條件下的葉黃素含量；A為葉黃素溶于無水乙醇中含量。

1.4 數據處理

每個試驗重復3次，通過Origin 8.0軟件繪圖，正交設計助手軟件進行正交試驗分析。

2 結果與討論

2.1 波長的選擇

將葉黃素標準品溶于無水乙醇中，在400～600 nm的范圍內測其吸光度，繪制葉黃素吸收光譜曲線，如圖1所示。

葉黃素在波長447 nm處時有其最大吸收峰，因此測定吸光度時，波長選447 nm。

圖1 葉黃素吸收光譜

2.2 標準曲線的繪制

配置梯度濃度的葉黃素-乙醇溶液，在其最大吸收波長（447 nm）處測定其吸光度，繪制標準曲線，如圖2所示。

由圖2可知，葉黃素-乙醇的標準曲線的線性回歸方程為y=27.212x-0.014 7，R2=0.997。由此可知，葉黃素在447 nm處的吸光度與葉黃素的濃度線性關系良好，可用于葉黃素的定量分析。

圖2 葉黃素的標準曲線

2.3 溫度對葉黃素穩定性的影響

取25 mL pH 8的葉黃素-乙醇溶液分別置于20～100℃恒溫水浴振蕩器中2 h，在447 nm處測其吸光度，并計算其含量及保存率。如圖3所示。

由圖3可知，葉黃素在溫度20～100 ℃，2 h條件下，葉黃素含量和保存率隨著溫度增加而降低，60 ℃時保存率為96.5%，而在100 ℃時葉黃素的保存率僅67%，說明葉黃素在常溫下具有較高的保存率，高溫條件下葉黃素較不穩定，溫度高于60 ℃時葉黃素的穩定性急速下降，損失較多。因此，為在葉黃素的生產及應用中達到良好效果，其加熱溫度應不超過60 ℃。

圖3 溫度對葉黃素穩定性的影響

2.4 加熱時間對葉黃素穩定的影響

取25 mL pH 8的葉黃素-乙醇溶液置于60 ℃的恒溫水浴振蕩器中，振蕩0～3 h，在447 nm處測其吸光度，并計算其含量及保存率。如圖4所示。

由圖4可知，葉黃素在60 ℃，不同時間的條件下，隨著加熱時間增加，葉黃素含量及保存率降低，加熱時間超過2 h，葉黃素的保存率急劇下降，說明加熱時間越長，葉黃素的穩定性越差。故葉黃素在制備應用中，加熱時間應不超過2 h。

圖4 加熱時間對葉黃素穩定性的影響

2.5 pH對葉黃素穩定性的影響

取25 mL pH 1～14的葉黃素-乙醇溶液置于恒溫水浴振蕩器中，在60 ℃、2 h條件下，在447 nm處測其吸光度，并計算其含量及保存率。如圖5所示。

由圖5可知，葉黃素含量及保存率隨著pH增加而增加，在趨于平穩，最后增加。pH 1～4時，其葉黃素含量和保存率較低，由于酸性過強，葉黃素被氧化，因此葉黃素的保存率較低，pH 5～13時，含量及保存率基本保持不變。但pH 14時，葉黃素含量增加，由于強堿性條件下葉黃素結構發生改變，有固體析出，因此含量升高。由于葉黃素-乙醇溶液接近pH 8，因此試驗選擇pH 8。

圖5 pH對葉黃素穩定性的影響

2.6 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上選擇溫度、加熱時間和pH 3個因素，并測定其吸光度，采用正交試驗設計方案，對葉黃素的穩定性進行研究，因子水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

由表2可以得出，不同因素對葉黃素的影響順序依次為溫度＞加熱時間＞pH，通過K值可知，其最佳條件為A2B2C1，且溫度具有顯著性。因此在葉黃素的生產及應用中應注意反應pH處于5～13之間，pH 7最佳；加熱時間不宜超過2 h；溫度不宜超過80 ℃。根據正交試驗結果可知，其在試驗生產中溫度80 ℃，加熱時間2 h，pH 7時葉黃素的穩定性最佳，保存率最高。

表2 葉黃素穩定性L9(34)正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

3 結論

葉黃素是一種功能性較強的色素，在食品添加劑中有著重要的地位，具有良好的開發前景。經試驗所得：葉黃素在447 nm處有最大吸收峰；在加熱溫度60℃時葉黃素的保存率為96.5%，而在100 ℃時葉黃素保存率僅67%，說明葉黃素在高溫條件下不穩定；pH 1～4時葉黃素被氧化，其含量和保存率較低，pH 5～13范圍內，其含量基本不變，葉黃素的穩定性較好，pH 14（強堿條件）時，葉黃素的結構發生變化，容易被氧化；經正交試驗表明，葉黃素穩定性的影響因素依次為溫度＞加熱時間＞pH，其中加熱溫度對葉黃素的穩定性影響最大，pH對葉黃素的穩定性的影響最小。溫度80 ℃，加熱時間2 h，pH 7時葉黃素的穩定性最好，保存率最高。試驗為葉黃素的保存與制備提供便利，對葉黃素的生產與應用領域提供有效的理論基礎與數據支持。