雙酶分步酶解紅花籽粕制備抗氧化肽

呂凱波*，朱文婷

武漢工商學院環境與生物工程學院（武漢 430065）

紅花籽粕是紅花籽經過壓榨提油后的副產物[1]，無毒、無異味，粗蛋白質含量為20%～60%，且消化率為77%[2]，是物美價廉、營養豐富、氨基酸組成齊全的純天然植物性蛋白源[3]。目前紅花籽粕的主要用途一般作為廉價的肥料和飼料[4]，造成了優質蛋白質資源的極大浪費。研究表明植物蛋白酶解后可獲得許多具有多種生物活性的肽，具有清除體內自由基的能力、清除身體內脂質過氧化物、保護紅細胞等生理功能[5]。目前已酶解出多種植物性抗氧化肽，如菜籽抗氧化肽[6]、玉米抗氧化肽[7]、大豆抗氧化肽[8]等。對于紅花籽粕，國內外學者把主要研究蛋白提取、酶解工藝及氨基酸分析等方面[9-11]。孫立等[12-13]用堿性蛋白酶Alcalase酶解紅花籽粕制備紅花籽抗氧化肽，通過超濾、凝膠過濾層析對產物進行分離純化，獲得抗氧化活性較強的紅花籽多肽，為利用紅花籽粕蛋白提供一定參考依據。

此次試驗在前期研究基礎上發現單酶酶解紅花籽粕效果一般[14-16]，故采用雙酶分步酶解工藝，以此來提高紅花籽粕的水解度和抗氧化性，為制備一種來源廣泛、無毒副作用的新型抗氧化劑提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花籽，新疆產地；木瓜蛋白酶（Papain，2 400 U/mg）、胰蛋白酶（Parenzyme，2 500 U/mg）、中性蛋白酶（Bɑcillus subtilisneutral protease，150 U/mg），購自諾維信公司；三氯化鐵、鐵氰化鉀、30%過氧化氫、硫酸、硼酸、鹽酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、酚酞、三氯乙酸、甲醛、堿性品紅、磷酸二氫鈉，鄭州萊博儀器設備有限公司；試劑均為分析純。

UNIVERSAL320高速冷凍離心機，Hettich有限公司；AUY120分析天平，Shimadzu Corpopa Tion Japan；722E可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；ALPHAL-2真空冷凍干燥機，德國M. Christ公司；HH恒溫水浴鍋，江蘇金壇中大儀器廠；PHS-25酸度計，上海雷磁儀器廠；C21-IH02E9電磁爐，浙江蘇泊爾股份有限公司；YP202N電子天平，上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅花籽粕抗氧化肽的制備[17]

采用超聲波輔助石油醚提取紅花籽油后，低溫干燥粉碎后過40目篩即為紅花籽粕。紅花籽粕經過雙酶分步酶解后，迅速沸水浴滅酶10 min，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為紅花籽粕抗氧化肽。

1.2.2 紅花籽粕酶解試驗設計[18]

選中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶組合，每種酶的酶解條件如表1所示[19-23]，組合順序如表2所示。酶解方法：稱取2.5 g紅花籽粕，加入50 mL蒸餾水，混勻，調pH，在一定溫度下進行第一步酶解（酶解條件及酶組合順序見表1和表2），酶解后沸水浴10 min滅酶；然后調至一定pH，進行第二步酶解（酶解條件及組合順序見表1和表2），酶解后，迅速在沸水浴滅酶10 min，以4 000 r/min離心10 min收集上清，進行水解度及還原力的測定。

表1 不同蛋白酶酶解工藝

表2 雙酶分步酶解試驗設計

1.2.3 水解度的計算

采用凱氏定氮法測定總氮量[24]；采用甲醛滴定法測定酶解液中游離氨基態氮含量[25]。

1.2.4 還原力的測定[13]

將紅花籽粕水解液稀釋1倍，取1.0 mL于試管中，依次加2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混合，于50 ℃水浴保溫20 min，迅速冷卻，然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，搖勻，以3 000 r/min離心10 min。吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度。以吸光度大小來反映酶解液還原力的大小，吸光度越大，表明酶解液的抗氧化性越強。

1.2.5 雙酶酶解試驗設計

根據1.2.2試驗設計測定酶解液水解度和還原力，得到最佳雙酶分步酶解順序。以5%底物濃度，按表3進行雙酶酶解正交試驗設計。

表3 雙酶酶解正交因素水平設計

2 結果與分析

2.1 最佳雙酶分步酶解順序的確定

由表3可知，加酶順序對酶解效果及產物的還原性影響較大，水解度由大到小依次為5＞3＞2＞6＞1＞4。根據其還原力由大到小依次為3＞2＞5＞4＞6＞1。根據水解度及還原力綜合比較，胰蛋白酶與中性蛋白酶、木瓜蛋白酶與中性蛋白酶效果突出。考慮到胰蛋白酶的經濟成本比較高，選擇3號試驗順序，即第一步采用木瓜蛋白酶酶解，第二步采用中性蛋白酶的雙酶分步酶解方法，此時酶解液水解度為66.05%，還原力為0.497。

表4 雙酶分步酶解試驗結果

2.2 雙酶酶解工藝的確定

在底物濃度5%，pH 7.0，酶解溫度55 ℃條件下加入木瓜蛋白酶酶解；調整pH為7.2，在酶解溫度55℃條件下加入中性蛋白酶酶解，測定酶解液還原力及水解度，結果如表5所示。各因素對水解度影響的主次為D＞B＞A＞C，即中性蛋白酶酶解時間對結果影響最大；各因素對還原力影響的主次為A＞B＞C＞D，即木瓜蛋白酶酶用量對結果影響最大；試驗在A2B1C2D3條件下水解度最高，達到84.85%，還原力為0.383；在A1B3C3D3條件下還原力最強，達到0.485，水解度為81.15%。比較2種工藝，酶解液水解度相差不大，但還原力差別較大。綜合考慮選擇還原力最高工藝條件作為最佳雙酶酶解工藝，即木瓜蛋白酶酶用量3 200 U/g，木瓜蛋白酶酶解時間1 h，中性蛋白酶酶用量6 400 U/g，中性蛋白酶酶解時間2 h。

表5 雙酶酶解正交分析結果表

2.3 雙酶分步酶解工藝驗證

在木瓜蛋白酶酶用量3 200 U/g，pH 7.0，55 ℃酶解1 h后，中性蛋白酶酶用量6 400 U/g，pH 7.2，55℃酶解2 h后，測定酶解液水解度及抗氧化性。結果表明：酶解液的水解度為87.93%±0.86%，還原力為0.489±0.002，此時酶解液具有良好的抗氧化性，可以作為植物源蛋白制備抗氧化肽的一種方法。

3 結果與討論

以紅花籽粕為原料，酶解法制備抗氧化肽時，雙酶酶解效果明顯優于單酶酶解，加酶順序對酶解效率及產物還原力影響較大；在雙酶分步酶解時，中性蛋白酶酶解時間對水解度影響最大，木瓜蛋白酶酶用量對還原力影響最大；木瓜蛋白酶酶用量3 200 U/g，pH 7.0，55 ℃酶解1 h后，中性蛋白酶酶用量6 400 U/g，pH 7.2，55 ℃酶解2 h為最佳雙酶酶解工藝；此時水解度可達到87.93%±0.86%，還原力為0.489±0.002，證明酶解液具有良好的抗氧化性。

此次試驗利用雙酶酶解紅花籽粕制備抗氧化活性肽，水解度高，反應條件溫和。利用食品級蛋白酶可直接生產安全性高的食用級活性肽[26]，提高了紅花籽粕的利用率，為紅花籽粕的精深加工開發利用提供思考方向。