細菌16S rDNA測序分析妊娠晚期孕婦感染B族鏈球菌對陰道微生態及母嬰結局的影響

盛群英，林雅真，崔曉潔，張軍能

(廈門市第五醫院婦產科，福建廈門 361101)

女性陰道微生態與生殖健康具有密切關系。在正常情況下，陰道內微生物與宿主、環境保持生態平衡。當女性妊娠時，微生物種群隨著妊娠與年齡的改變而改變[1]。正常孕婦陰道微生態中以乳桿菌為優勢菌，陰道內pH值水平較低，小于4.5，為弱酸性。若陰道微生物生態破壞，多以乳桿菌數量下降，菌群多樣性增加為特征。有文獻報道，妊娠晚期孕婦陰道內微生物生態破壞可影響母嬰結局，嚴重者可導致胎兒早產、胎膜早破等危險情況發生[2]。目前臨床上多以傳統方法從菌群多樣性、密集度、機體炎癥等方面評估陰道微生態，具有一定評估價值，但過程較慢且復雜[3]。核糖體亞基16S rDNA基因序列為鑒定細菌常用位點，且該位點存在于所有細菌染色體基因中，可分類鑒定陰道微生物菌群。為此，本研究將采用16S rDNA測序分析妊娠晚期孕婦陰道微生態對母嬰結局的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1—10月在本院建檔的妊娠晚期孕婦3 700例為研究對象，年齡22～40歲，平均(30.92±8.89)歲；孕周28～40周，平均(26.49±13.48)周；孕次1～2次，平均(1.91±0.89)次。本研究經醫學倫理會批準，所有孕婦及家屬簽署知情同意書。納入標準：(1)孕周≥28周，早、中、晚胎動次數共5～10次；(2)經超聲檢查示單胎。排除標準：(1)合并心腦血管疾病；(2)溝通障礙或精神異常者；(3)先兆流產、前置胎盤等產科復雜情況；(3)檢測前1個月內有陰道局部用藥史。

1.2方法

1.2.1標本的采集 采用一次性無菌陰道拭子(浙江拱東醫療科技有限公司)在孕婦陰道里1/3側壁取分泌物，采樣過程中應避免接觸采樣區以外部位，采樣后快速置入試管，并于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2B族鏈球菌性質的鑒定 以B族鏈球菌運送增菌顯色培養基配套，已采集標本拭子送至實驗室，置入35 ℃條件下的5%二氧化碳培養箱中18～24 h，B族鏈球菌運送增菌顯色培養基呈胡蘿卜色則為陽性。未顯現胡蘿卜色的B族鏈球菌運送增菌顯色培養基再轉入二分格、血平板，再置入于35 ℃條件下的5%二氧化碳培養箱18～24 h。二分格平板呈現胡蘿卜色且菌落β溶血則B族鏈球菌陽性。二分格平板僅出現β溶血(二分格平板可誘導γ溶血B族鏈球菌出現β溶血)、血平板上可疑菌落則采用儀器鑒定明確后判定陽性，其余判定為陰性。

1.2.3提取DNA 使用Invitrogen DNA提取試劑盒完成DNA提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外微量分光光度法行DNA質檢。

1.2.4設計引物和擴增PCR及產物提純 16S rDNA擴增區V3-V4，采用F341、R806為通用引物，并在其5′端加適宜HiSeq2500 PE250測序的接頭、index序列，特異性引物完成。5′-ACT CCT ACG GGR SGC AGC AG(F341)-3′為正向引物序列，5′-GGA CTA CVV GGG TAT CTA ATC(R806)-3′為反向引物序列。經稀釋后的DNA為參照板，采用Invitrogen Platinum SuperFi高保真酶行PCR擴增，擴增體積(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，HotStarTaq DNA Polymerase 0.5 μL，5×Q-Solution 10 μL，100 mmol/L dNTP 0.5 μL，Primer各1 μL，UNG 0.3 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 26.7 μL。擴增條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，10個循環；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，25個循環，最后于72 ℃ 10 min，4 ℃恒溫；并保障擴增區高效、準確。檢測PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳，后采用 DNA凝膠回收試劑盒，將PCR產物行切膠回收，提升產物純度。采用質粒抽提試劑盒抽提質粒DNA，嚴格按試劑說明書操作。測序反應PCR：1 μL BigDye，0.5 mL BigDyeseq Buffer，1MI M13或T7通用引物(3.2 pmoL/μL)，1 μL質粒DNA，1.5 μL ddH2O。96 ℃ 1 min，96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，25個循環，60 ℃ 4 min，4 ℃恒溫，正反向測序。以ABI公司提供的標準品作為陽性對照。測序反應PCR產物用乙醇/EDTA沉淀法純化，Hi-Di Formamide溶解DNA后，95 ℃變性4 min，迅速置冰中冷卻4 min，然后在ABI3100XL基因分析儀上樣電泳。

1.2.5測序結果分析 采用ABI Sequencing Analysis V5.4軟件對測序結果進行低質量去除后，測序結果直接在NCBI的Blast進行序列比對分析，Megalign軟件對序列進行聚類分析，觀察樣本中序列的相似性程度進行分類，統計信息。

1.2.6物種鑒定 將同序列與微生物參考數據庫作對比分析獲得同一物種分類信息，并采用QIIME軟件將同源序列相似度為97%的物種歸為同一物種。并采用RSP Classifier對各樣本群落進行門、綱、目、科、屬水平統計。質控菌株為參照標本：血鏈球菌ATCC10556、乳桿菌ATCC7830、普氏菌BNCC351994、加德納菌ATCC 14018、雙歧桿菌CICC6071、厭氧球菌ATCC27337，購于北納生物科技有限公司。

上述方法中所有試劑盒購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。對所有妊娠晚期孕婦隨訪至生產后3個月，隨訪率100%。觀察晚期孕婦陰道微生態菌群及致病菌對母嬰結局的影響。

1.3統計學處理 使用Miseq PE300行16S rDNA基因測序及生物學分析。對原始數據行質量控制后，提取物種序列采用Usearch系統對數據行去嵌合體與聚類分析，而后采用QIIME系統與16S數據庫進行比較，最后得物種豐度表，并根據該物種豐度表進行物種分類、豐度、Alpha多樣性、Beta多樣性分析。采用SPSS22.0軟件進行統計分析，計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1物種類別分析 共鑒定41 110個物種。依據物種在樣品中豐度，計算個體樣品間共同擁有與特別物種，根據對所有孕婦行物種聚類分析后發現，感染B族鏈球菌233例孕婦中檢出特有物種4 522個，未感染B族鏈球菌3 467例孕婦檢出特有物種6 577個，共同擁有30 011個物種。感染B族鏈球菌一側物種總數少于未感染菌一側。物種累積曲線由急速升高到緩慢升高，見圖1，由此說明本研究結果較為可靠，樣本充分。根據物種分類結果，將孕婦分為B族鏈球菌感染組(n=233)與未感染組(n=3 467)。

圖1 物種及微生物群差異分析

2.2陰道微生態物種分類和豐度分析 選擇各個物種中最高豐度序列為代表序列，使用核糖體數據庫項目(RDP)法，將已知物種16S數據庫與最高豐度代表序列行對比分析，并注釋結果，將等級分為門、綱、目、科、屬，并根據分類等級對B族鏈球菌感染組與未感染組做相應的物種解剖柱狀圖，得物種相對豐度圖。結果顯示，感染組厚壁菌門、擬桿菌門豐度小于未感染組(78.36%vs. 81.25%，6.13%vs. 8.71%)，且放線菌門大于未感染組(10.63%vs. 8.12%)。感染組芽孢桿菌綱、放線菌綱豐度高于未感染組(76.38%vs. 67.45%，5.77%vs. 4.43%)，梭菌、擬桿菌綱低于未感染組(10.24%vs. 11.98%，3.54%vs. 8.85%)。感染組雙歧桿菌目、乳桿菌目豐度高于未感染組(10.56%vs. 5.33%，70.68%vs. 65.33%)，擬桿菌目、梭菌目低于未感染組(5.89%vs. 6.67%，12.47%vs. 15.33%)。感染組雙歧桿菌科、西德梭狀芽孢桿菌科、鏈球菌科豐度高于未感染組(11.12%vs.6.25%，8.34%vs. 5.90%，1.08%vs. 0.69%)，乳桿菌科、擬桿菌科低于未感染組(58.42%vs. 61.83%，1.00%vs. 2.08%)。感染組鏈球菌屬、厭氧球菌屬、雙歧桿菌屬豐度高于未感染組(1.95%vs. 0.87%，4.55%vs. 1.95%，9.09%vs. 0.31%)，加德納菌屬、普氏菌屬、乳桿菌屬及糞桿菌屬、其他菌種豐度均低于未感染組(3.90%vs. 6.49%，3.25%vs. 5.19%，60.39%vs. 62.34%，0.32%vs. 0.65%，12.34%vs. 16.37%)。對物種豐度位于前20菌屬行分類計數，結果顯示感染組與未感染組中厚壁菌門的乳桿菌屬無顯著變化，但感染組中鏈球菌屬、厭氧球菌屬顯著增加；感染組中屬放線菌門的雙歧桿菌增加，加德納菌屬下降，使放線菌門所有物種數顯著增加；另感染組中擬桿菌門的卟啉單胞菌屬、普氏菌屬下降導致擬桿菌門所有物種數下降。

2.3多樣性分析

2.3.1Alpha多樣性指數分析 使用QIIME系統計算樣本的Alpha多樣性指數值顯示，感染組物種數量低于未感染組(P<0.05)，見表1。

表1 Alpha多樣性指數差異比較(%)

2.3.2Beta分析

2.3.2.1相似性分析 若統計R值>0，表示組間差異大于組內，分組合理；若R值<0，表示組間差異小于組內，分組較不合理。本研究計算R值=0.150，表示組間差異大于組內(P=0.001)。

2.3.2.2非度量多維尺度法(NMDS)分析 研究結果顯示，兩組樣本距離相近，存在相似物種，但有相分離趨勢。

2.3.2.3多響應置換程度(MRPP)分析 a為MRPP組間差異分析統計量，本研究計算a=0.019>0，表示組內差異小于組間；ED=0.504，表示值越大組間差異越大；P=0.001<0.05，表示差異有統計學意義。

2.4感染B族鏈球菌與妊娠結局的關系 感染組胎兒窘迫、羊水污染、早產、宮內污染發生率高于未感染組，差異有統計學意義(P<0.05)；且感染組發生胎兒窘迫、羊水污染、早產、宮內污染的風險(OR)是未感染組的8.562、7.297、7.156、7.280倍，見表2，提示B族鏈球菌感染本身或其造成的菌群變化與上述不良妊娠結局相關。

表2 感染B族鏈球菌與妊娠結局的關系[n(%)]

2.5感染B族鏈球菌與新生兒病理性結局的關系 感染組新生兒感染、窒息、病理性黃疸、肺炎發生率高于未感染組，差異有統計學意義(P<0.05)；且感染組發生新生兒感染、窒息、病理性黃疸、肺炎的OR是未感染組的4.929、3.852、5.000、3.619倍，見表3，提示B族鏈球菌感染或其造成的菌群變化與上述新生兒病理性結局相關。

表3 感染B族鏈球菌與新生兒病理性結局的關系[n(%)]

3 討 論

女性陰道內微生態菌群正常情況下與內部環境相制約，形成以乳桿菌占絕對優勢的陰道微生態環境，并維持動態平衡。有研究指出，妊娠期孕婦體內雌激素水平顯著升高，且隨著妊娠周期改變，妊娠晚期孕婦的激素水平高于妊娠早期孕婦，陰道內細胞通透性也隨之增加，其生理改變導致黏膜屏障功能降低，使細菌快速滋生、繁殖，引起陰道微生態紊亂[4]。因此，妊娠晚期孕婦陰道微生態更易紊亂。若妊娠晚期孕婦陰道微生態發生紊亂可引發相關疾病，嚴重可威脅胎兒與母體生命[5]。因此，早期對妊娠晚期孕婦行相關檢測具有重要意義。目前臨床上多采用傳統方法評價妊娠晚期孕婦陰道微生態。隨著測序技術的發展，16S rDNA基因序列為分子鑒定細菌常用位點，在陰道微生態菌群分析中發揮較大優勢。為此，本研究通過對妊娠晚期孕婦行16S rDNA測序分析陰道微生態，并對其母嬰結局的影響進行分析。

16S rDNA是所有細菌染色體基因上相對DNA序列。有研究指出，16S rDNA在細菌DNA中含量高達80%，具有種類較少、含量大、相對分子質量適中、進化性好、保守性高的特點，能同時顯示不同菌屬間差異，并利用測序技術可得到該序列[6]。16S rDNA分析是利用細菌序列測序法對其行種屬鑒定，包括細菌基因DNA提取、引物PCR擴增、產物純化、測序、序列比較等，可快速獲取細菌種屬[7]。在妊娠中晚期健康孕婦陰道內包含偶爾、過路、常駐細菌，其中過路細菌包括消化鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌、腸桿菌、金黃色葡萄球菌等。常駐細菌有乳酸菌、B族鏈球菌、大腸埃希菌、糞鏈球菌、梭菌、擬桿菌等。陰道乳酸桿菌是妊娠晚期健康孕婦陰道內有益細菌，正常情況下，孕婦陰道內機會性病原體與常駐細菌相互制約，達到相對平衡[8]。B族鏈球菌為寄生于人體泌尿生殖道、下消化道內的細菌。但由于妊娠晚期孕婦體內激素水平發生變化，且隨孕周增加，使其陰道微生態菌群相互約制力遭受破壞，失去平衡，陰道pH值偏弱酸性[9]，導致B族鏈球菌成為機會致病菌。在臨床上，妊娠晚期孕婦陰道中，B族鏈球菌感染常可導致不同程度的炎癥和病理改變。孕婦泌尿生殖道內若發生B族鏈球菌感染，可改變母嬰結局，造成不良影響，嚴重者引起新生兒死亡。因此，及時對高風險孕婦進行篩查，提供針對性的干預、治療方法，可降低不良妊娠結局的發生風險，降低母嬰患病率。本研究通過對妊娠晚期孕婦行細菌16S rDNA測序分析發現，孕婦陰道微生態中共鑒定出物種41 110個，其中感染B族鏈球菌的個體中存在4 522個特有物種，未感染組則有6 577個，兩組共同擁有的物種達30 011個。其中共同物種多為常駐菌。既往資料顯示，炎癥表現顯著的孕婦，陰道內細菌豐度較低[10]。本研究結果顯示，感染組中雙歧桿菌、鏈球菌增加，加德納菌則減少。當陰道內發生B族鏈球菌感染時，雙歧桿菌發生改變，有研究認為，陰道內感染與雙歧桿菌增加有關[11]，增加的雙歧桿菌使其陰道酸堿環境破壞，使陰道內加德納菌生長受到抑制。另有文獻報道，在陰道炎癥疾病中，雙歧桿菌與加德納菌存在相互競爭作用，當加德納菌數增長時，雙歧桿菌生長受抑制，反之亦然[12]。另有研究發現，宮頸癌在發展過程中，可使陰道內加德納菌屬增加、乳酸桿菌屬降低、物種多樣性增加，說明加德納菌屬的繁殖可引發陰道pH值發生改變，抑制乳酸桿菌屬生長，同時可破壞陰道內上皮細胞保護因子，導致病菌大量黏附、定植陰道表面，最終使其總物種多樣性增加。 已有文獻報道，感染B族鏈球菌嚴重威脅母嬰安全，不僅可導致孕婦出現胎兒窘迫、羊水污染、早產、宮內污染等，還可導致新生兒出現感染、窒息、病理性黃疸、肺炎等并發癥[13]。本研究結果顯示，感染組胎兒窘迫、羊水污染、早產、宮內污染發生率高于未感染組，差異有統計學意義(P<0.05)；新生兒感染、窒息、病理性黃疸、肺炎發生率高于未感染組，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究采用分子生物技術對妊娠晚期孕婦行細菌16S rDNA測序同時對陰道微生態物種進行鑒定，發現部分孕婦存在B族鏈球菌感染，并對其從門、綱、目、科、屬水平對細菌物種豐度進行分析，提示感染組孕婦陰道微生態環境已發生改變。

本研究納入研究年限較短，可能使相關研究結果存在誤差，待后期樣本量擴大后再深入研究。另外，本研究僅發現B族鏈球菌感染可造成陰道內菌群變化，并與妊娠期母嬰不良結局相關，但尚未有直接證據證明菌群失調與不良妊娠結局的因果關系，有待進一步研究。

綜上所述，細菌16S rDNA測序可準確反映妊娠晚期孕婦陰道內微生態情況及感染B族鏈球菌對母嬰結局的影響，為該病的干預、治療提供參考，可一定程度上減少疾病對母嬰結局的影響。