分光光度法測定葡萄糖含量的研究

師改琴，李心怡，孫雅琪，靳文濤，王隨錕，李茹，梁振海

（太原理工大學現代科技學院，山西 孝義 032300）

葡萄糖是一種產量大、應用廣、價格便宜易得的醛基糖，也是一種最常見的單糖。由于天然葡萄糖水溶液旋光向右，故屬于 “右旋糖”[1-2]。葡萄糖用途很廣泛，廣泛的應用在醫學、食品和工業制造等行業中。在醫學方面，葡萄糖主要作為營養劑（葡萄糖注射液）運用在臨床上。還可以用于葡萄糖鹽水口服液、葡萄糖酸鹽、維生素C等藥品的生產中[3]。在食品工業方面，葡萄糖是食品中的重要營養成分，廣泛存在于初級食品和加工食品中，可以經異構酶處理后制造果糖，尤其是含42%果糖的果葡糖漿，已成為當前制糖工業的重要產品[4]。在工業方面，葡萄糖可以在印染制革工業中作還原劑，在制鏡工業和熱水瓶膽鍍銀工藝中常用葡萄糖作還原劑[5]。葡萄糖作為人體中樞神經系統血糖能源的來源，其含量過多或過少均會引起糖尿病、腎病、視網膜和神經系統的并發癥等病癥[6-9]。因此，建立快速、便捷的葡萄糖測定方法對醫用化學和食品分析有著十分重要的意義。

目前對葡萄糖含量的測定方法常用的有滴定分析法[10]、碘量法[11]、高效液相色譜法[12]、酶電極法[13]、旋光法[14]、比色法[15-16]。滴定分析法適用于常量組分的測定，系統誤差較大。高效液相色譜法檢測結果準確度高，但對儀器及實驗條件的要求也高。酶電極法成本較高，不適合實驗室用。旋光法操作簡單快捷，但在實驗過程中，存在很多不穩定因素影響測量結果的準確率。比如在量取、稀釋、熱壓滅菌過程中容易使葡萄糖分解，導致測量的葡萄糖含量的誤差偏大。比色法操作簡單快捷、準確率高，儀器簡單，僅需要一臺分光光度計。本文采用DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸試劑）和分光光度計測量并計算出未知溶液中葡萄糖的含量，準確度高。為后續的葡萄糖轉化率的計算提供了一種方法。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑與儀器見表1。

表1 實驗試劑和儀器

1.2 實驗過程

1）配制溶液。顯色劑的配制：稱取3，5-二硝基水楊酸6.5 g，加入少量的水使其溶解，然后定量轉移到1000mL的棕色容量瓶中；稱取80 g的氫氧化鈉，溶解后配制成2 mo1／L的氫氧化鈉溶液，量取325 mL轉移到裝有3，5-二硝基水楊酸的棕色容量瓶中，再向其中加入稱取好的丙三醇46.24 g，搖勻后放置冷卻，冷卻后用蒸餾水定容到刻度線，搖勻。

系列標準溶液的配制：

將葡萄糖于烘箱中105℃下2h烘干，然后放在干燥器中保存備用。稱取上述烘好的葡萄糖10 g，然后加少量的水溶解后轉移至1000 mL的容量瓶中，稀釋定容配制成標準溶液。取7個干燥的100 mL的容量瓶，分別移入0、10、20、30、40、50、60 mL，稀釋定容，即配得濃度分別為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg／mL的系列葡萄糖標準溶液。

2）測量波長的選擇。用吸量管吸取0.0、2 mL的上述配好的濃度為3.0 mg／mL葡萄糖標準溶液分別加入兩個25 mL的容量瓶中，再分別加入2 mL的3，5-二硝基水楊酸溶液，蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻放置。分別取2 mL的上述溶液在中沸水浴加熱2min，自然冷卻。以未加入葡萄糖標準溶液的試劑為參比溶液，在440～560 nm，每隔20 nm測一次吸光度。圖1為吸光度與波長關系的吸收曲線。由圖1看出，最大吸收波長為510 nm，但分光光度計最佳測量值吸收范圍為0.2～0.8 A[16]，所以最終確定相對最大吸收波長540 nm。

圖1 吸收光譜圖

3）DNS顯色試劑用量的確定。比色分析方法中，常常需要加入稍過量的顯色劑。但顯色劑如果加入太多，容易引起副反應。取六個25 mL的容量瓶分別加入1 mL不同濃度的葡萄糖標液，分別加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的 DNS試劑，沸水浴反應2min，自然冷卻，蒸餾水定容至刻度線，以相同條件下不加葡萄糖的溶液作空白對照，在540 nm下測定吸光度值。圖2為DNS顯色劑用量與吸光度的關系曲線。由圖2看出，DNS顯色試劑用量在0.5～1.5 mL時，吸光度值隨DNS試劑的用量增大而增大，DNS試劑用量超過1.5 mL時，DNS用量繼續增大，吸光度值處于平緩狀態。所以，選擇DNS試劑用量為1.5 mL。

圖2 顯色試劑用量對吸光度的影響

4）顯色時間的確定。取5份3.0 mg／mL的葡萄糖標液1 mL，分別加入1.5 mL的DNS試劑。沸水浴中分別加熱1、2、3、4、5、6、7 min，自然冷卻后在540 nm下測定吸光度值。圖3為顯色時間與吸光度的關系曲線。

圖3 反應時間對吸光度的影響

由圖3看出，反應時間在1～2min內反應產物的吸光度值隨著反應時間的增加而呈上升趨勢，反應時間超過2min后產物吸光度值不再隨著反應時間的增加而增大，處于平緩狀態。所以，反應時間最佳為2min。

5）反應溫度的確定。取5份3.0 mg／mL的葡萄糖標液1 mL，分別加入1.5 mL的DNS試劑。分別在溫度為70、80、90、100、110℃沸水浴中加熱2 min，自然冷卻后在540 nm下測定吸光度值。圖4為反應溫度與吸光度的關系曲線。由圖4看出，反應產物的吸光度值隨著溫度的增加而呈上升的趨勢，當反應溫度超過100℃后，產物吸光度值不再隨著反應溫度的增加而增大，處于平緩狀態。所以，反應溫度最佳為100℃。

圖4 反應溫度對吸光度的影響

6）葡萄糖標準工作曲線的繪制。分別移取一定梯度的葡萄糖系列標準溶液在上述最優條件下測其吸光度做標準曲線。圖5為標準曲線。

7）標準曲線回歸方程的繪制。由圖5看出，葡萄糖質量濃度在1～8 mg／mL范圍內與DNS試劑反應后反應液的吸光度值與葡萄糖濃度之間呈良好的線性關系。

8）標準曲線法測定未知溶液中葡萄糖的含量。未知溶液：前期的葡萄糖雙極電化學反應后陰陽兩極產物。運用該方法可以計算葡萄糖的轉化率。將電解液的濃度稀釋到上述標準曲線中葡萄糖的濃度范圍內，在上述測得的最佳條件下測其吸光度，然后在標準工作曲線上找出對應的葡萄糖的濃度。再根據當初稀釋的倍數計算出電解液中葡萄糖的真實濃度。

9）重復性試驗。用質量濃度為3.0 mg／mL的葡萄糖標液與DNS試劑在上述測得的最佳條件下反應，在波長540 nm處連續測定6次吸光度，測定結果見表2。由表2看出，同一質量濃度的葡萄糖溶液與顯色劑DNS的反應液在波長540 nm處測定的吸光度值標準偏差很小，說明該方法重復性好，準確率高。

圖5 DNS法測定萄糖含量標準曲線

表2 重復性實驗測量結果

取稀釋后的未知溶液加入DNS顯色劑后在上述條件下連續6次測其吸光度，結果看出測得的吸光度值標準偏差很小，說明該方法重復性好，準確率高，可以運用在計算葡萄糖轉化率的應用中。

2 結果與討論

經實驗確定的 DNS法測定葡萄糖含量的最佳波長為540 nm，DNS顯色試劑用量為1.5 mL，顯色時間最佳為5min。精密度試驗表明該方法的準確率高，運用該方法測得未知溶液中葡萄糖的濃度，為葡萄糖電解反應提供了計算葡萄糖轉化率可行的方法。