鐵皮石斛破壁粉工藝參數(shù)對(duì)質(zhì)量參數(shù)的影響研究

石 雪，唐明華，陳毅堅(jiān)，黃雕順

(1.云南品斛堂生物科技有限公司，云南 保山 678300；2.云南師范大學(xué)，云南 昆明 650000；3.云南民族大學(xué)，云南 昆明 650000；4.黔西南州南盤(pán)江國(guó)有林場(chǎng)，貴州 興義 562400)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo．)是蘭科石斛屬多年附生草本植物，以新鮮或者干燥莖入藥，也叫黑節(jié)草[1]。野生鐵皮石斛為國(guó)家重點(diǎn)二級(jí)保護(hù)植物。《本草正義》記載：“必以皮色深綠，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，生嚼之脂膏黏舌，味厚味甘者為上品，名鐵皮鮮斛，價(jià)亦較貴。”[2]鐵皮石斛不僅具有較高的生態(tài)價(jià)值，而且具有較高的藥用價(jià)值。《中國(guó)藥典》一部(2015版)收載石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并將“鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)”單獨(dú)列出[3]。近年大量藥理實(shí)驗(yàn)表明，鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗疲勞、降血糖、護(hù)肝等作用[4-10]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的改善、人們對(duì)健康認(rèn)知的加深及人們對(duì)鐵皮石斛功效認(rèn)知的不斷提升，鐵皮石斛產(chǎn)品走進(jìn)千家萬(wàn)戶(hù)。過(guò)去鐵皮石斛的產(chǎn)品多以鐵皮石斛、鐵皮楓斗、切片、寸金條等原料產(chǎn)品為主，現(xiàn)如今市場(chǎng)需求的擴(kuò)大給鐵皮石斛的發(fā)展帶來(lái)了機(jī)遇。截至2019年2月，已獲得國(guó)家批準(zhǔn)的鐵皮石斛相關(guān)產(chǎn)品包括鐵皮石斛膠囊、鐵皮石斛顆粒、鐵皮楓斗晶等99種[11]。在新的發(fā)展機(jī)遇下，需要不斷豐富鐵皮石斛的產(chǎn)品形態(tài)。

破壁粉：細(xì)胞經(jīng)破壁粉破壁后更容易被人體吸收到其有效成分，提高利用率。破壁技術(shù)的興起，為鐵皮石斛的深加工提供了一種新的思路。接下來(lái)需要研究：哪些因數(shù)對(duì)鐵皮石斛破壁粉的生產(chǎn)工藝有影響，鐵皮石斛破壁粉生產(chǎn)工藝如何影響鐵皮石斛質(zhì)量參數(shù)[12-13]。本研究進(jìn)行了相關(guān)探索，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鐵皮石斛采摘于云南龍陵，經(jīng)昆明植物研究所楊青松副研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛。鐵皮石斛植株洗凈后，將莖切斷，于60 ℃恒溫干燥，干燥過(guò)程中不間斷用快速水分測(cè)定儀測(cè)定鐵皮石斛干料的含水量，將含水量為2%、4%、6%、8%、12%、14%時(shí)的樣品各取出5 kg；取含水量為12%的干料200g用普通粉碎機(jī)進(jìn)行打粉，全部通過(guò)3號(hào)篩作為對(duì)照樣品。D-甘露糖對(duì)照品(中檢院)(99.4%)，D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中檢院)(99.9%)；DL-鹽酸氨基葡萄糖(中檢院)(100.0%)；色譜純甲醇(默克)、色譜純乙腈(默克)、(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)PMP(西格瑪)、苯酚、硫酸、無(wú)水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷等試劑均為國(guó)藥分析純、娃哈哈純凈水。

1.2 主要儀器

島津電子分析天平(SHIMADZU)；島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1900型)；島津(LC2030)高效液相色譜儀；恒溫干燥箱；恒溫水浴鍋；離心機(jī)；沃特斯(waters)高效液相色譜柱(型號(hào)C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)、鹵素水分測(cè)定儀(SHIMADZU)、振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)(XDW-15B)。

2 方法

2.1 醇溶性浸出物測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》一部2015版鐵皮石斛醇溶性浸出物測(cè)定方法[3]，以95%乙醇為溶劑測(cè)定鐵皮石斛醇溶性浸出物。

取鐵皮石斛樣品約3 g，并精密稱(chēng)定，將鐵皮石斛置250 mL的錐形瓶中，精密添加95%乙醇100 mL，密塞，精密稱(chēng)定重量，靜置1 h，采用冷凝管回流法，加熱至沸騰，并保持1 h。放冷至室溫，取下錐形瓶，密塞，再稱(chēng)定重量，用95%乙醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，過(guò)濾，濾液精密量取25 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，在105 ℃干燥箱中干燥3h，置干燥器中冷卻30 min，快速精密稱(chēng)定重量。以鐵皮石斛干燥品計(jì)算醇溶性浸出物的含量(%)。

M1為蒸發(fā)皿重量，M2為蒸發(fā)皿恒重后重量，M3為鐵皮石斛重量，M4為蒸發(fā)皿和鐵皮石斛重量，M5為蒸發(fā)皿和鐵皮石斛干燥恒重后重量，X為干燥失重。

2.2 多糖含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》一部2015版鐵皮石斛多糖含量測(cè)定方法[3]，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[14]。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備方法 精密稱(chēng)定無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.022 53 g，置于200 mL容量瓶中，用純化水定容至200 mL所得溶液含葡萄糖為90.1 μg/mL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法 用移液槍精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置10 mL具塞比色管中，分別加純化水補(bǔ)至1.0 mL，精密量取5%苯酚溶液(臨用配制)1 mL，混勻，再精密加硫酸5 mL，混勻，放入沸水中加熱20 min，取出，放入冰水混合物中冷卻5 min，空白試樣的制備用純化水替代葡萄糖對(duì)照溶液，在488 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)(Y)，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=17.60X-0.118(R2=1.000 0)。

2.2.3 鐵皮石斛樣品的制備方法 取鐵皮石斛(過(guò)3號(hào)篩)粉末約0.3 g，精密稱(chēng)定，精密加入純化水200 mL，回流加熱2 h，放冷至室溫，將其全部轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，并少量多次用純化水洗滌一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，用純化水定容至刻度并搖勻、過(guò)濾，精密量取濾液2 mL，放入15 mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，搖勻冷藏1 h后取出，在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心20 min，將上清液棄去，所得沉淀加80%乙醇8 mL，共洗滌2次，離心，棄去上清液，沉淀用熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，放冷至室溫，加純化水至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 樣品測(cè)定方法 精密量取鐵皮石斛供試品溶液1 mL，置于10 mL具塞比色管中，按照鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度(A)，用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖的量，即得多糖含量。

2.3 甘露糖含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》一部2015版鐵皮石斛甘露糖含量測(cè)定方法[3]，以甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，采用甘露糖衍生物法測(cè)定甘露糖含量[16-18]。

2.3.1 色譜分析條件及系統(tǒng)適用性條件 以乙腈(C2H3N)-0.02mol/L的乙酸銨(C2H7NO2)溶液20∶80為流動(dòng)相，沃特斯(Waters)高效液相色譜柱(型號(hào)C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)；在250nm波長(zhǎng)檢測(cè)條件下。理論塔板數(shù)應(yīng)不低于4 000(按甘露糖峰計(jì)算)。

2.3.2 校正因子測(cè)定 精密稱(chēng)定DL-鹽酸氨基葡萄糖1.200 05 g，置于100 mL容量瓶中，加純凈水使溶解并定容至刻度，搖勻得含DL-鹽酸氨基葡萄糖含量為12.000 5 mg /mL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。精密量取內(nèi)標(biāo)溶液1 mL和精密稱(chēng)定D-甘露糖對(duì)照品0.010 2 g，置于100 mL容量瓶中，加入純凈水適量，使溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取400 μL，加入1-苯基-3-甲基-5-P比唑啉酮(PMP)甲醇溶液(0.5 mol/L)與氫氧化鈉溶液(0.3 mol/L)各400 μL，搖勻，于70 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)100 min。再加鹽酸溶液500 μL(0.3 mol/L)，搖勻，用三氯甲烷(分析級(jí))2 mL/次洗滌3次，棄去三氯甲烷層，水層在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL于樣品瓶中，10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算校正因子。

表1 校正因子測(cè)定

2.3.3 鐵皮石斛樣品測(cè)定法 取鐵皮石斛粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.12 g，精密稱(chēng)定，以80%乙醇為溶劑，索氏提取中加熱回流4 h，取出藥渣并揮干乙醇，將濾紙和藥渣置于燒杯中，加水100 mL，再精密加入DL-鹽酸氨基葡萄糖內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，煎煮并持續(xù)攪拌1 h，放至室溫，在100 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，離心，精密量取上清液1 mL，置于頂空瓶中，加鹽酸溶液0.5 mL 3.0 mol/L，封口，混勻，在110 ℃恒溫干燥箱中水解1h，放至室溫，用氫氧化鈉溶液(3.0 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至中性，精密量取400 μL，照校正因子測(cè)定方法制備，自“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”起，操作結(jié)束后，取上清液注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照樣品 取純凈水400 μL，依據(jù)校正因子測(cè)定方法，從“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”開(kāi)始操作，可得。

2.3.5 精密度測(cè)試 吸取供試品溶液，按照甘露糖含量測(cè)定方法中的色譜條件，進(jìn)樣6次，測(cè)定甘露糖的含量，計(jì)算結(jié)果RSD=0.78%。

2.3.6 穩(wěn)定性測(cè)試 吸取供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)，按照甘露糖含量測(cè)定方法中的色譜條件，測(cè)定甘露糖的含量，計(jì)算結(jié)果RSD=0.94%，說(shuō)明甘露糖的衍生物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性測(cè)試 取相同來(lái)源藥材，按照甘露糖含量測(cè)定方法平行制備供試品溶液6份，按照甘露糖含量測(cè)定色譜條件分別進(jìn)樣，檢測(cè)甘露糖的含量，計(jì)算結(jié)果RSD=1.78%(n=6)。

2.3.8 加樣回收測(cè)試 精密稱(chēng)取已知甘露糖含量的鐵皮石斛樣品6份，準(zhǔn)確加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖)，按照甘露糖含量測(cè)定的方法，制備供試品溶液，測(cè)定結(jié)果回收率為99.60%，RSD為1.75%。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 甘露糖與葡萄糖峰面積比測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》一部2015版鐵皮石斛中甘露糖/葡萄糖峰面積比測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品精密稱(chēng)定0.010 04 mg，置于200 mL容量瓶中，加純凈水使溶解并定容至刻度得D-無(wú)水葡萄糖50 μg/mL的對(duì)照品溶液。按照甘露糖含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算甘露糖/葡萄糖峰面積比值。

3 樣品含量測(cè)定

3.1 鐵皮石斛含水量對(duì)鐵皮石斛破壁粉工藝和質(zhì)量的影響

取含水量為2%、4%、6%、8%、12%、14%鐵皮干料各200g，在振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)(XDW-15B)-15 ℃條件下粉碎30 min。取出樣品分別編號(hào)，分別按“2”下項(xiàng)方法制備供試品并計(jì)算測(cè)定，不同樣品測(cè)定分析及計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 鐵皮石斛含水量對(duì)鐵皮石斛破壁粉工藝及質(zhì)量參數(shù)的影響

由表3可知：普通粉碎機(jī)與振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)對(duì)鐵皮石斛粉碎后，對(duì)甘露糖含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響；對(duì)浸出物、多糖、甘露糖與葡萄糖峰面積比測(cè)定結(jié)果差異顯著。振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)在相同的粉碎溫度(-15 ℃)、粉碎時(shí)間(30 min)的條件下對(duì)不同含水量的鐵皮石斛粉碎測(cè)定結(jié)果表明：甘露糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(1.6%)<多糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(7.8%)<浸出物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(11.9%)<甘露糖與葡萄糖峰面積比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(31.7%)。甘露糖含量的測(cè)定結(jié)果與鐵皮石斛含水量沒(méi)有關(guān)系；浸出物含量隨著鐵皮石斛含水量的降低而升高；多糖測(cè)定結(jié)果隨著水分的降低而增加；浸出物隨著水分的降低而增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著水分的降低而降低。

3.2 鐵皮石斛粉碎時(shí)間對(duì)鐵皮石斛破壁粉工藝和質(zhì)量的影響

取含水量6%鐵皮干料1 200 g平均分成6份，在振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)(XDW-15B)-15 ℃條件下粉碎5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。取出樣品分別編號(hào)，分別按“2”項(xiàng)方法制備供試品并計(jì)算測(cè)定，不同樣品測(cè)定分析及計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 鐵皮石斛粉碎時(shí)間對(duì)鐵皮石斛破壁粉工藝及質(zhì)量參數(shù)的影響

由表4可知：普通粉碎機(jī)與振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)對(duì)鐵皮石斛粉碎后，對(duì)甘露糖含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響；對(duì)浸出物、多糖、甘露糖與葡萄糖峰面積比測(cè)定結(jié)果差異顯著。振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)在相同的粉碎溫度(-15 ℃)、含水量(6%)的條件下對(duì)鐵皮石斛粉碎不同粉碎時(shí)間測(cè)定結(jié)果表明：甘露糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(2.3%)<多糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(8.6%)<浸出物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(13.0%)<甘露糖與葡萄糖峰面積比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為(32.4%)。甘露糖含量的測(cè)定結(jié)果與鐵皮石斛粉碎溫度沒(méi)有關(guān)系；浸出物含量隨著鐵皮石斛粉碎溫度的降低而升高；多糖測(cè)定結(jié)果隨著粉碎溫度的降低而增加；浸出物隨著粉碎溫度的降低而增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著粉碎溫度的降低而降低。

3.3 鐵皮石斛粉碎溫度對(duì)鐵皮石斛破壁粉工藝和質(zhì)量的影響

取含水量6%鐵皮石斛干料1 200 g平均分成6份，在振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)(XDW-15B)溫度為25 ℃、15 ℃、5 ℃-5 ℃、-15 ℃、-25 ℃的條件下粉碎30 min。取出樣品分別編號(hào)，分別按“2”項(xiàng)方法制備供試品并計(jì)算測(cè)定，不同樣品測(cè)定分析及計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 鐵皮石斛粉碎溫度對(duì)鐵皮石斛破壁粉工藝及質(zhì)量參數(shù)的影響

由表5可知：普通粉碎機(jī)與振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)對(duì)鐵皮石斛粉碎后，對(duì)甘露糖含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響；對(duì)浸出物、多糖、甘露糖與葡萄糖峰面積比測(cè)定結(jié)果差異顯著。振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)在相同的粉碎時(shí)間(30 min)、含水量(6%)的條件下對(duì)鐵皮石斛粉碎不同粉碎溫度測(cè)定結(jié)果表明：甘露糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(1.3%)<多糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(7.6%)<浸出物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(10.3%)<甘露糖與葡萄糖峰面積比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為(28.9%)。甘露糖含量的測(cè)定結(jié)果與鐵皮石斛粉碎溫度沒(méi)有關(guān)系；浸出物含量隨著鐵皮石斛粉碎溫度的降低升高；多糖測(cè)定結(jié)果隨著粉碎溫度的降低增加；浸出物隨著粉碎溫度的降低增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著粉碎溫度的降低而降低。

4 討論

鐵皮石斛在振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)粉碎所得粉的質(zhì)量參數(shù)隨著鐵皮石斛粉碎的工藝參數(shù)含水量、粉碎時(shí)間、粉碎溫度的影響而變化。粉碎的工藝參數(shù)對(duì)甘露糖含量的測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響；浸出物、多糖隨著含水量的降低而增加、粉碎時(shí)間的增加而增加、粉碎溫度的降低而增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著含水量的降低而減小、粉碎時(shí)間的增加而減小、粉碎溫度的降低而減小。可以看出：鐵皮石斛含水量、粉碎時(shí)間、粉碎溫度是鐵皮石斛破壁粉生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)，含水量越低、粉碎時(shí)間越長(zhǎng)、粉碎溫度越低越有利于鐵皮石斛破壁；但當(dāng)含水量小于等于8%、粉碎時(shí)間超過(guò)30 min、溫度低于-5 ℃時(shí)影響趨于穩(wěn)定。

鐵皮石斛經(jīng)過(guò)振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)粉碎后甘露糖含量保持不變；浸出物、多糖測(cè)定結(jié)果增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比減小，說(shuō)明鐵皮石斛粉碎工藝對(duì)鐵皮石斛質(zhì)量參數(shù)有顯著影響。

鐵皮石斛經(jīng)過(guò)破壁粉碎后質(zhì)量參數(shù)差異顯著，有效成分多糖、浸出物含量增加，破壁后多糖有效成分更有利于溶解出來(lái)，甘露糖含量保持一致，破壁粉浸出物升高使得葡萄糖含量增加，從而導(dǎo)致甘露糖與葡萄糖峰面積減小。鐵皮石斛的有效成分主要為糖類(lèi)，鐵皮石斛的破壁對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響顯著。

本研究結(jié)果與《中國(guó)藥典》一部(2015版)記載相符，但鐵皮石斛原料經(jīng)過(guò)破壁處理后，浸出物、多糖、甘露糖/葡萄糖峰面積比檢測(cè)指標(biāo)發(fā)生了顯著變化；更多的有效成分被溶解檢出，說(shuō)明對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行破壁深加工處理的研究有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。后期仍需對(duì)破壁粉的深加工工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入研究。醇溶性浸出物、多糖及甘露糖/葡萄糖峰面積比可作為研究鐵皮石斛破壁粉工藝研究和工藝優(yōu)化的檢測(cè)指標(biāo)。