基于不同腫瘤部位的中藥路路通抗腫瘤藥效成分篩選研究

楊欣欣，王 帥，李天嬌，包永睿*，孟憲生

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

中藥路路通始載于《本草綱目拾遺》，為金縷梅科植物楓香樹LiquidambarformosanaHance的干燥成熟果序。2015版《中國藥典》記載中藥路路通味苦、性平，歸肝、腎經，具有祛風活絡、利水通經的功效[1]，可用于關節痹病、麻木拘攣、水腫脹滿、乳少、經閉的治療。現代藥理學研究表明，路路通具有保肝、抗腫瘤、消炎等作用[2-5]。《素問》中云：“經脈者，所以決生死，處百病，調虛實，不可不通。”現代中醫認為，腫瘤是長期經絡氣血瘀滯所致的結果，經絡系統與腫瘤的發生發展及治療有著極為密切的聯系。

本文根據中藥路路通的歸經，選擇人源肝癌體外藥理模型；根據功能主治，選擇人源宮頸癌、乳腺癌體外藥理模型[6-7]；根據臨床治療病癥，選擇人源胃癌、肺癌、結腸癌體外藥理模型，以尋找其治療疾病的主要部位及歸經與功能主治的相關性。同時開展石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇、水5種提取液的體外藥效評價研究，以確定中藥路路通的藥效部位，為其抗腫瘤藥效組分的確定、后期的活性評價及新藥開發奠定前期實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人結腸癌細胞株Caco-2、人肝癌細胞株SMMC-7721、人胃癌細胞株HGC-27、人非小細胞肺癌細胞株A549、人宮頸癌細胞株Hela、人乳腺癌細胞株MCF-7均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)；SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)；臺式冷凍離心機(美國Thermo公司)；-80 ℃超低溫冰箱(海爾公司)。

1.3 藥材與試劑

路路通藥材購自安國市啟美藥材有限公司，由遼寧中醫藥大學中藥植物教研室許亮教授鑒定為金縷梅科植物楓香樹LiquidambarformosanaHance的干燥成熟果序；小牛血清(北京全式金生物技術有限公司)；DMEM高糖培養基干粉(美國GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；EDTA(天津基準化學試劑有限公司)。

1.4 供試品溶液配制

路路通水提取液：取干燥藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1 000 mL水溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，用蒸餾水配制成相應生藥濃度的藥液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即得。

路路通95%乙醇提取液：取干燥藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1 000 mL乙醇溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，用蒸餾水配制成相應生藥濃度的藥液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即得。

路路通二氯甲烷提取液：取干燥藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1 000 mL二氯甲烷溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，用蒸餾水配制成相應生藥濃度的藥液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即得。

路路通乙酸乙酯提取液：取干燥藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1 000 mL乙酸乙酯溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，用蒸餾水配制成相應生藥濃度的藥液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即得。

路路通石油醚提取液：取干燥藥材粗粉約100 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1 000 mL石油醚溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，用蒸餾水配制成相應生藥濃度的藥液，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即得。

2 方法與結果

2.1 細胞培養

2.1.1 人肺癌A549細胞株 人肺癌A549細胞株按常規貼壁細胞培養法接種于含體積分數為10%胎牛血清的RP-1640培養基中，在溫度為37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規培養。

2.1.2 人乳腺癌MCF-7細胞株 人乳腺癌MCF-7細胞株按常規貼壁細胞培養法接種于含體積分數為10%胎牛血清、0.01mg/mL胰島素的RP-1640培養基中，在溫度為37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規培養[8]。

2.1.3 人肝癌SMMC-7721細胞株 同“2.1.1”項下方法操作。

2.1.4 人宮頸癌Hela細胞株 人宮頸癌Hela細胞株按常規貼壁細胞培養法接種于含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養基中，在溫度為37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規培養。

2.1.5 人結腸癌Caco-2細胞株 同“2.1.4”項下方法操作。

2.1.6 人胃癌HGC-27細胞株 同“2.1.4”項下方法操作。

2.2 MTT法體外藥效檢測

取培養2～3天、處于對數生長期、生長狀態良好的不同部位的腫瘤細胞，經PBS清洗2次，每次1 mL，用1 mL的胰蛋白酶(濃度為0.25%)消化，待細胞趨于變圓用培養液終止消化，并沖洗吹打細胞制成細胞懸液。于細胞計數板上計數，加培養液稀釋至濃度為5×104個/mL，接種于96孔培養板，每孔100 μL，繼續培養約12 h待細胞貼壁完全。設加藥試驗孔、空白對照孔(加細胞，但不加藥物)，每組設5個復孔。繼續培養24 h后，每孔避光加20 μL(5 mg/mL)MTT，繼續于37 ℃培養箱中培養4 h后吸凈孔內上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床振搖10 min，用酶標儀在492 nm處掃描，測定吸光值(OD)，結果見表1、表2、表3、表4、表5、表6。

表1 路路通對結腸癌Caco-2細胞株的抑制率考察

續表1

表2 路路通對胃癌HGC-27細胞株的抑制率考察

表3 路路通對肝癌SMMC-7721細胞株的抑制率考察

表4 路路通對乳腺癌MCF-7細胞株的抑制率考察

續表4

表5 路路通對肺癌A549細胞株的抑制率考察

由以上實驗結果可知，路路通5種提取液對6種不同部位的腫瘤細胞均有一定的抑制作用，綜合不同極性物質組對不同部位腫瘤細胞的IC50值，發現二氯甲烷和乙酸乙酯提取物表現出更顯著的抗腫瘤活性，且乙酸乙酯提取物更優。對于不同部位腫瘤細胞，中藥路路通對人肝癌細胞株SMMC-7721、人胃癌細胞株HGC-27、人非小細胞肺癌細胞株A549的抑制作用優于其他3種腫瘤細胞。

表6 路路通對宮頸癌Hela細胞株的抑制率考察

2.3 Pearson相關性分析

根據不同極性路路通提取物的體外不同腫瘤部位的IC50值，首先將影響整體行為的數據進行分列，以反映系統不同腫瘤部位藥效行為特征的數據序列為參考數列，即母序列，以影響系統不同極性藥效行為的因素數據序列為比較數列，即子系列。采用Pearson相關性進行分析，得出不同藥效部位的關聯系數(見表7)。

實驗結果表明肝癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌之間的相關系數較大，肺癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌之間的相關系數較大，結腸癌與肝癌、乳腺癌相關系數較大。

3 討論

本實驗根據路路通的歸經及功能主治，選取人源的肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌細胞，采用MTT法研究路路通不同極性物質組在一定濃度范圍內對6種不同部位腫瘤細胞的體外抑制作用，發現不同提取物對肝、肺、胃、乳腺、結腸、宮頸6種腫瘤細胞均表現出不同程度的抑制作用，呈現出較好的量-效關系。在查閱的相關中醫古籍文獻后，綜合其不同組織部位的IC50值及相關系數結果，驗證了中醫古籍中肝經不通出現的病癥，包括頸椎病、眼病、兩肺脹痛、乳腺增生、婦科病等，同時上述實驗結果與古籍結論有很大的相似性，表明中醫對于疾病的論述是有一定的科學依據，該結果為中醫歸經治療疾病及探討腫瘤之間的相關性提供了一定的實驗依據。

表7 不同腫瘤部位相關性分析

同時，結合石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇、水5種不同極性物質組對不同部位腫瘤細胞IC50值的綜合結果，發現路路通乙酸乙酯提取物的抗腫瘤效果更優。此外，根據路路通對不同部位腫瘤細胞的IC50值初步判定其抗腫瘤作用的強弱，順序為(肝癌)SMMC-7721>(胃癌)HGC-27>(肺癌)A549>(宮頸癌)Hela>(乳腺癌)MCF-7>(結腸癌)Caco-2。故選擇路路通乙酸乙酯提取物，針對其抗肝癌藥理活性進行后續實驗研究。