青蒿含量測定方法及其性狀與成分關系研究

張 媛，李瑞海，賈天柱

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

青蒿為菊科植物黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)的干燥地上部分[1]，具有清熱、解暑、截瘧、涼血、利尿、止盜汗等功效[2]。現代藥理研究表明，倍半萜、香豆素、揮發油、黃酮等物質是青蒿所含的主要成分[3]，其中青蒿素作為青蒿最有效的抗瘧成分已經被業界認可。紀曉光等[4]通過鼠瘧模型研究青蒿的化學成分與青蒿素配伍的藥效學實驗發現，青蒿酸和東莨菪內酯對于青蒿素的抗瘧藥效具有很強的增效作用。藥理研究表明東莨菪內酯在抗炎、抗腫瘤、降壓等方面也有很好的療效[5]。目前2015版《中國藥典》尚無青蒿的主要成分含量測定方法，因此本研究選取青蒿素、青蒿酸和東莨菪內酯3種成分作為含測指標成分，對于青蒿質控具有一定意義。本研究收集16個產地不同青蒿樣品，對青蒿進行含量測定，并對其主要成分和性狀之間的關系進行初步研究，以期從性狀描述反映藥材青蒿內在成分質量的規律。

1 儀器、試劑

1.1 儀器

1100 Series 系列高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司，安捷倫色譜工作站)；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；SF-130B 型高速粉碎機(上海冠聯制藥裝備有限公司)；AS3120 型超聲提取器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；CP225D 型 十萬分之一電子天平(Sartorius)等。

1.2 試劑

東莨菪內酯對照品(批號：190609)、青蒿素對照品(批號：190618)、青蒿酸對照品(批號：190506)購于大連美侖生物技術有限公司；甲醇、乙腈(色譜純，西隴科學股份有限公司)；水為純凈水；各批青蒿藥材購于全國各地(見表1)，經遼寧中醫藥大學藥學院許亮教授鑒定為黃花蒿的地上部分。

表1 青蒿樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱(WelchPolarRP)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸緩沖溶液(B)，梯度洗脫(0～30 min，10%～55%A；30～38 min，55%～75%A；38～42 min，75%～90%A)；檢測波長220 nm；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 精密稱取對照品東莨菪內酯、青蒿素、青蒿酸，加甲醇配制成每毫升含東莨菪內酯0.10 mg、青蒿素9.2 mg、青蒿酸0.52 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約1 g，精確稱定，置圓底燒瓶中，精密加入乙醇60 mL，稱重，回流2 h，放冷，再稱重，用乙醇補足減失的質量，過濾，取續濾液揮發至干，殘渣用甲醇溶解轉移并定容至25 mL容量瓶中，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 專屬性實驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各20 μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果對照品的分離度良好，且與供試品中的其他成分無干擾，見圖1。

2.4 標準曲線的繪制

精密吸取混合對照品溶液(東莨菪內酯2.75 mg/mL、青蒿素13.25 mg/mL、青蒿酸4.105 mg/mL)，0.10 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL和20.0 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積。以對照品進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標Y，得回歸方程及線性范圍見表2，結果表明東莨菪內酯、青蒿酸、青蒿素對照品有良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品20 μL，連續進樣6次，測定峰面積，測得3種對照品的峰面積RSD分別為1.2%、0.5%、0.52%，說明本試驗精密度良好。

1.東莨菪內酯；2.青蒿素；3.青蒿酸；A.混合對照品；B.供試品

表2 各成分的回歸方程及線性范圍

2.6 重復性試驗

取1號樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行HPLC測定，結果3種對照品的含量RSD(n=3)分別為1.5%、0.9%、1.4%，說明本方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取1號供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、2 4h進樣測定，結果3種對照品的峰面積RSD(n=3)分別為2.1%、1.6%、2.0%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗

取1號樣品粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按樣品含量-對照品(1∶1)加入東莨菪內酯1.159 0 mg/mL、青蒿素6.056 0 mg/mL、青蒿酸2.044 0 mg/mL各1mL，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行HPLC測定，計算回收率，結果回收率分別為100.0%、99.7%、98.9%，RSD分別為1.5%、1.1%、2.2%，符合相關規定。

2.9 青蒿不同性狀樣品中主要成分的含量測定

2.9.1 含量測定結果 根據《中國藥典》規定，青蒿莖直徑為0.2～0.8 cm，本實驗將每批青蒿飲片樣品的莖根據粗細劃分成三類(組一)：粗莖(>0.8 cm)、中粗莖(0.2～0.8 cm)、細莖(<0.2 cm)；按照莖葉破碎程度將每批樣品劃分成兩類(組二)：完整莖葉、破碎莖葉。按“2.2.2”項下制備方法進行制備，“2.1”項下色譜條件測定，結果見表3。

2.9.2 含量測定結果分析 通過所得的實驗數據直觀來看，不同粗細程度的青蒿莖中，東莨菪內酯的含量差別較大；不同破碎程度的莖葉中倍半萜類成分的含量也有所差異，為進一步探究組間差異性的顯著性，將所得結果用SPSS 17.0進行數據分析。結果見表4、表5、表6。

表3 不同粗細程度的莖中東莨菪內酯含量 (mg·g-1)

表4 不同直徑青蒿莖中東莨菪內酯含量方差分析結果 (n=16)

表5 多重比較結果

表6 不同破碎程度青蒿莖葉中萜類含量的t檢驗結果 (n=16)

3 討論

實驗初期對提取溶劑和提取方式進行了考察，比較了不同濃度的乙醇、甲醇通過超聲和回流提取青蒿藥材的HPLC色譜，其中以乙醇為提取溶劑，回流2 h的色譜峰較多，且峰形好，提取效果最好，故本實驗最終確定用乙醇回流提取。

根據前期對青蒿不同部位含量測定的結果得知，東莨菪內酯主要存在于青蒿的莖中，在青蒿的葉和果實中含量甚微；而青蒿酸和青蒿素這兩種倍半萜類成分大量存在于青蒿的葉和果實中，在青蒿的莖中含量較少，因此本次研究選取東莨菪內酯的含量作為比較組一間差異的指標成分，選取青蒿素和青蒿酸的含量之和作為比較組二間差異的指標成分。

從SPSS分析結果來看，組一的P=0.009<0.05，而組二的P=0.267，可以認為不同直徑的青蒿莖中，東莨菪內酯的含量有顯著性差異；而在破碎程度不同的青蒿莖葉中，倍半萜含量的差異性并不顯著。在此之后對組一項下的3組進行多重比較，細莖(<0.2 cm)和粗莖(>0.8 cm)兩組的指標成分含量的差異最顯著，其P=0.02。由此可以得出結論，直徑<0.2 cm的青蒿飲片東莨菪內酯的含量最高，可以將此作為判斷青蒿飲片質量的依據之一，而青蒿莖葉的破碎程度也可作為判斷其質量的輔助條件。從實驗結果來看，本研究初步建立了青蒿外在性狀與內在質量間的聯系，可以認為莖越細、破碎葉子越多的青蒿有效成分含量越高。

2015版《中國藥典》雖然增加了理化指標和現代分析技術，但只能評判藥材是否合格，并不能對其優劣進行區分；而當今常用的藥材已有600多種，現行的藥材商品規格標準只對76種中藥材進行了規格、等級的劃分，顯然遠遠不能滿足如今的市場需求。將傳統鑒別方法與現代科學技術結合起來，將主觀性和客觀性結合起來是值得進一步研究的課題。