夏天無醇提物對實驗性腦出血大鼠的干預作用及機制研究

潘榮斌，占惠唯，鄒進發，張 迪，陳 喬

(江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性所致的腦實質自發性出血，常見病因有高血壓、顱內血管畸形、腦動脈硬化等，其主要癥狀表現為突然昏迷、半身不遂、口舌歪斜、言語不利或失語、偏麻等[1]。在國內一項流行病學調查統計發現，ICH發病率高達85.4/10萬，其病死率更高達41.3%，且患者慢性傷殘率為39.1%[2]。可見，ICH已成為目前世界范圍內一個危害人類健康的社會問題，研究其發病機制及干預治療手段具有重要的現實意義。

研究證實ICH最重要病理改變是血腫本身及其繼發性周圍腦缺血、腦水腫和細胞毒性等損傷[3]，其中最常見的是炎性介質和凝血酶變化，參與損傷機制的過程相互作用。由此，保護ICH性腦組織損傷關鍵在于抗炎及消腫[4]。但目前ICH發生、發展病理機制尚不清楚，且目前治療方法缺乏循證醫學證據及明確病理機制支撐，更缺乏特異性靶向性治療。在諸多中藥材中，夏天無有活血化瘀、消炎止痛的功效，臨床實驗證實復方夏天無治療類風濕關節炎療效好[5]，其對炎癥反應各個環節，如炎性滲出、炎性介質釋放以及炎癥后期肉芽組織增生均具有抗炎作用[6]。本課題組運用夏天無醇提物干預ICH模型大鼠，通過神經行為學、病理變化及NF-κB、GFAP、CD34蛋白免疫組化檢測，旨在探討夏天無對ICH大鼠的干預作用及其可能作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗選用SPF級2月齡健康雄性SD大鼠70只，體重(200±20)g，合格證號為SCXK(湘)2016-0002，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。環境溫度(25±2)℃，相對濕度55%～65%，自由飲水。本實驗通過動物倫理委員會審核。

1.2 藥品

藥品均購于江西省中醫院藥房。夏天無飲片生藥(批號：20150715)；腦血康膠囊(山東昊福藥業集團有限公司，批號：Z10960009)。

1.3 主要儀器設備

OLYMPUS顯微鏡系統(日本OLYMPUS公司)；石蠟切片機(RM2135型，德國Leica公司)；石蠟包埋機(德國Leica公司)；真空旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；培養性/干燥箱兩用箱(上海一恒科技有限公司)。

1.4 主要試劑

DAB顯示劑(博士德生物科技有限公司，批號：CW0125M)；SABC免疫組化染色試劑盒(博士德生物科技有限公司，批號：12G20B)；兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(Abcam公司，批號：ab16502)；兔抗鼠CD34多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0646R)；兔抗鼠GFAP單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0199R)。

2 實驗方法

2.1 藥液制備

稱取夏天無飲片500 g加入500 mL的95%乙醇浸泡過夜后，冷凝回流水浴80 ℃提取30 min，倒出藥液，再加入300 mL的95%乙醇提取15 min后倒出，合并藥液，轉移至旋轉蒸發儀濃縮至50 mL，轉移至蒸發皿內，烘干形成膠狀提取物；后用雙蒸水及適量吐溫-80溶解，配成相對生藥濃度為2、1、0.5 g/mL的藥液，于冰箱4 ℃保存備用。用生理鹽水將腦血康膠囊配制成濃度為30 mg/mL藥液備用。

2.2 動物分組

大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組、用藥高、中、低濃度組及術前用藥組，每組10只。

2.3 造模

麻醉、備皮、消毒。正中切開顱頂皮膚約1.5 cm，輕輕刮除顱骨表面腱膜及顱骨外膜。參照大鼠腦圖譜，在顱頂前囟前0.96 mm，正中矢狀線右側3 mm處切開一個1 mm×1 mm 左右小孔，暴露硬腦膜(注意保護硬腦膜完整)。用37 ℃溫水加溫鼠尾，待其充血后酒精消毒，斷尾取血，迅速用微量注射器吸取新鮮血液50 μL。腦立體定位儀固定微量注射器，調整針尖移至開孔處，以輕微接觸硬腦膜為宜，設置Z軸原點，調整Z軸向下移動6 mm[7]。采用二次注血二次退針法進行造模，即先注入10 μL，停針2 min，繼續緩慢勻速注入40 μL，留針約4 min，退針2 mm，再停針約4 min，緩慢將注射器完全退出[8]。停針期間，對鼠尾傷口進行消毒止血處理。術后用骨蠟封閉顱骨創口，縫合頭皮并用碘伏消毒，防止傷口感染。假手術組大鼠前期操作一致，注血步驟時，僅將針插入，不注射血液。

2.4 給藥

所有動物按1次/d、1 mL/100 g量給藥。術前用藥組于造模前灌胃30 d，夏天無醇提物量相對生藥濃度為1 g/mL，高、中、低濃度組生藥濃度分別為2、1、0.5 g/mL，陽性對照組腦血康濃度30 mg/mL，模型組及假手術組以等體積生理鹽水灌胃即可。以上大鼠均在麻醉清醒后(約術后3 h)開始給藥，直至7 d后處死取材。

2.5 神經行為學檢測

按Longa法進行大鼠神經行為學評分[9]，標準見表1。自造模后第2天開始，對各組大鼠進行神經性行為評價。將大鼠輕置于空曠平坦的地面，不對其行動進行干擾，只觀察并記錄其運動情況，根據評分標準進行評分。

2.6 HE染色

給藥結束后，將大鼠灌注固定并取材[10]，取大鼠注血中心點前后2 mm區組織塊，包埋后連續冠狀位切片，片厚4 μm，修片后，每隔3片取1張，每樣本相鄰切片分為四套，每套6張，選取一套做常規HE染色，光學顯微鏡觀察。

表1 大鼠神經行為學評分標準

2.7 免疫組化檢測

剩余切片用于免疫組化染色，兔抗鼠NF-κB多克隆抗體稀釋濃度為1∶200，兔抗鼠GFAP單克隆抗體稀釋濃度為1∶400，兔抗鼠CD34多克隆抗體稀釋濃度為1∶400。顯微鏡下(10×40倍)觀察注血周圍區NF-κB、GFAP及CD34陽性表達情況，每張切片隨機選取3個相鄰視野，采集圖像后，軟件Image J2x，計算相應的平均光密度值，以3個視野平均光密度值之和平均數作為一個標本計數值，再以該值對各組大鼠注血尾殼核周邊區平均光密度值總數作統計學分析。

2.8 統計學處理

實驗數據用(平均數±標準差)表示，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，先將數據做正態分布檢驗以及方差齊性檢驗，各組間免疫組化結果采用單因素方差分析，方差分析具有顯著性時，組間兩兩比較進行配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 longa評分結果

參照評分標準，對各實驗組大鼠進行各時間段神經行為學評分，因剔除死亡或造模失敗原因減員，每組剩余6只進行后續實驗，觀察預防及治療效果。

表2 大鼠神經行為學評分

通過大鼠神經行為學評分結果可見，所有實驗組與假手術組相比較均具有顯著性差異(P<0.01)，在藥物治療7 d后，術前用藥組及用藥低濃度組與假手術組有統計學差異(P<0.05)；用藥組與模型組相比，陽性對照組、用藥高濃度組、用藥中濃度組、用藥低濃度組在用藥前5 d幾乎無差別，無統計學意義；用藥第6天，陽性對照組、用藥高濃度組、用藥中濃度組、用藥低濃度組與模型組均有統計學差異(P<0.05)；用藥第7天，陽性對照組、用藥高濃度組、用藥低濃度組與模型組均有統計學差異(P<0.05)；術前用藥組與模型組相比，第1、2、4天時，與模型組均有統計學差異(P<0.05)，第7天時，與模型組有顯著性差異(P<0.01)。

3.2 夏天無醇提物對組織實驗性ICH注血周圍區腦組織病理形態學影響結果(HE染色)

假手術組注血區周圍組織緊密，細胞形態完整，染色均勻，腦白質完整，邊界清晰，核仁清晰明顯，胞質均勻；模型組注血區周圍組織較為松散，壞死細胞較多，細胞核濃縮，胞質淡染，腦白質受損嚴重，邊界模糊，出現水腫現象；各給藥組注血區周圍組織緊密程度不一，但均較模型組更為緊密，細胞壞死程度不一，但均較模型組少；伊紅染色較為均勻，均沒有出現濃染，腦白質均受到一定程度的損傷，但沒有模型組嚴重，部分邊界清晰。

不同濃度給藥組差異明顯，用藥高濃度組注血區周圍組織最為緊密，用藥中濃度組次之，用藥低濃度組最為松散；用藥高濃度組形態完好的細胞最多、壞死細胞最少，用藥低濃度組形態完好細胞最少、壞死細胞最多；三組伊紅染色都較為均勻，未出現伊紅濃染情況，用藥高濃度組腦白質受損最輕，部分邊界清晰，用藥中濃度組腦白質受損程度居中，邊界較為模糊，用藥低濃度組腦白質受損較為嚴重，邊界模糊，詳見圖1。

3.3 夏天無醇提物對大鼠尾殼核周邊區NF-κB蛋白表達的影響(免疫組化)

在藥物治療7 d后，所有大鼠處死取材尾殼核手術區周圍NF-κB蛋白表達隨著炎癥程度的升高而增加，與假手術組相比，實驗組均有統計學差異(P<0.05)，其中與模型組、術前用藥組、用藥中濃度組、用藥低濃度組有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組、術前用藥組均有顯著性差異(P<0.01)，用藥高濃度組、用藥低濃度組有顯性差異(P<0.05)，而用藥中濃度組差異無統計差異(P>0.05)。詳見表3。

3.4 夏天無醇提物對大鼠尾殼核周邊區GFAP蛋白表達的影響(免疫組化)

假手術組腦組織GFAP陽性表達細胞較少，染色淺，細胞規則，輪廓清晰，分布較為規律。模型組腦組織GFAP陽性細胞表達最多，表達量最高，同時在形態上，細胞胞體增大，突起明顯且不規則，部分呈簇狀分布，與用藥組及假手術組相比，均有顯著性差異(P<0.01)，具統計學意義。數據顯示，GFAP表達量與用藥濃度成反比，詳見表3。

圖1 夏天無醇提物對組織實驗性ICH注血周圍區腦組織病理形態學影響(HE染色10×40)

3.5 夏天無醇提物對大鼠尾殼核周邊區CD34蛋白表達的影響(免疫組化)

各組間比較差別有統計學意義，其中假手術組CD34陽性微血管數較少，模型中表達量最高，用藥干預組與陽性用藥對照組均低于模型組，在用藥組織CD34的表達與濃度呈一定的反比關系，見表3。

表3 夏天無對大鼠尾殼核周邊區NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達的影響

4 討論

ICH作為致死率與致殘率極高的一類疾病，在全球發病率為10～30人/10萬[11]，占腦卒中總數的10%～15%。Flaherty ML等[12]對ICH患者進行了2個隊列研究，統計發現，1周的病死率為30%，1年內病死率為50%以上，該研究組隨后對183名患者進行10年隨訪，其病死率高達82%。ICH導致如此高死亡率最重要的病理改變是血腫本身及其引發的繼發性周圍腦缺血和腦水腫及細胞毒性等損傷[1]。Hua等[13]認為出血后的血腫占位并不是引起ICH損傷的關鍵因素，而出血后腦水腫所引起的繼發性傷害及釋放的活性物質是造成ICH損傷的主要因素，其中最常見的是炎性介質和凝血酶的變化，而參與損傷機制的過程又相互作用，由此，保護ICH性腦組織損傷的關鍵在于抗炎及消腫。核轉錄因子(NF-κB)作為一個重要介質激活和釋放多種炎癥介質參與ICH后的炎癥反應，造成腦損傷[14]。一方面可以促進炎性因子IL-1β、ICAM-1等的表達[15]，另一方面，上調MMP-9的表達，破壞血腦屏障，加重血管源性腦水腫[16]并促進細胞凋亡的發生[17]。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)作為星形膠質細胞的特異性標志物，檢測GFAP蛋白表達變化，可以有效反映星形膠質細胞反應性增生情況及神經系統損傷程度[18]。在出現腦出血情況時，出血區周圍組織水腫、缺血缺氧，刺激星形膠質細胞對GFAP的合成，并增加神經營養因子的分泌[19]，以提升神經元短期內的耐受性；隨著后期炎癥的加劇，星形膠質細胞受損GFAP向周圍彌散，形成片區分布。CD34分子是一類高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，在眾多炎癥反應中異常出現表達，介導白細胞的聚集，啟動炎癥反應，同時協同趨化因子作用增強炎癥反應[20]。

大鼠腦血管解剖結構與人類相似，尾殼核是腦內最大核團，易于定位且位于基底節，是人類高血壓ICH的好發部位[21]。采用自體血注入尾殼核法制作的ICH模型進行的研究發現，ICH后的繼發性腦損害和水腫形成的機制是多方面的，同時，大鼠未肝素化模型產生的水腫比肝素化模型嚴重[22]。因該模型產生效果與臨床病癥相似，自體血注入尾殼核法用于制作ICH模型，相比其他方法而言，實驗結果將更加可靠，具有穩定性以及可復制性[23-25]，已被大多數研究所采用。

傳統中藥夏天無臨床常用于治療腦梗死，周圍神經損害性癱瘓、腰椎間盤突出癥、癡呆、坐骨神經痛、關節腰腿等疼痛等[26-30]。將夏天無應用于大鼠實驗性腦血栓模型中發現，夏天無能夠抑制血栓的形成，減輕腦血栓引起的腦水腫及腦損傷[31]，并有相關研究表明夏天無對喹啉酸損毀海馬所致大鼠學習記憶障礙具有明顯的改善作用[32]。

本實驗設置術前用藥組，術后高、中、低用藥干預組，陽性對照組等不同組別，采用神經行為學評價、HE染色形態學觀察及免疫組化檢測進行效果評價。結果顯示，夏天無術前給藥30 d后，能夠較大程度緩解自體血注射對大鼠行為學變化及降低注血周圍區NF-κB、GFAP及CD34蛋白的表達，即表明夏天無醇提物具有一定程度的ICH預防作用。從不同時間段各組大鼠神經行為學變化可以發現，隨著給藥時間的延長，恢復速度逐漸增強，分析原因可能與用藥干預及大鼠自體恢復共同作用的結果。最后，不同濃度夏天無給藥干預后，NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達存在明顯差異，初步結果顯示，NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達與給藥濃度呈負相關性，即給藥濃度越高，NF-κB、GFAP、CD34蛋白越少，反之亦然。此現象表明，夏天無醇提物對實驗性ICH具有治療作用，能夠改善實驗性腦出血大鼠行為學作用，用藥后ICU區病變程度降低，NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達減少。由此得出結論：夏天無醇提物對腦出血大鼠具有預防和治療作用，推測其神經保護作用機制可能與抑制腦出血處血栓形成及消除炎癥反應相關。