灸療對(duì)失眠大鼠腦組織γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)及組穴配伍研究

乎寶力格，澈力木格，高玉峰

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007)

失眠不僅僅是老年人的常見(jiàn)癥狀，而且越來(lái)越年輕化，嚴(yán)重影響人們的健康。這與社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力的日益加劇及人際關(guān)系的復(fù)雜化有關(guān)，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

蒙醫(yī)灸療法(拖吶胡扎薩拉)為蒙醫(yī)傳統(tǒng)療法之一，是將艾草條或艾草柱燒灼后在人體特定穴位或病變部位，直接或間接地給予溫?zé)岣卸_(dá)到預(yù)防或治療目的。《素問(wèn)·異法方易論》中有“北方者，天地所閉藏之域也。其地高陵居，風(fēng)寒冰冽，其民樂(lè)野處而乳食，藏寒生滿病，其治宜灸，故灸焫者，亦從北方來(lái)”的記載。

灸療法療效奇特、無(wú)毒副作用、簡(jiǎn)便易操作，在治療失眠、焦慮、抑郁方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。蒙醫(yī)學(xué)中赫依三穴指的是頂會(huì)穴(敖瑞音博樂(lè)其日)、赫依穴(赫依音博樂(lè)其日)、黑白際穴(哈日查干乃博樂(lè)其日)。赫依穴(赫依音博樂(lè)其日)位于頸椎第七棘突與胸椎第一棘突間隙窩中，主治：心悸、夜不安寐、白晝嗜眠、耳聾、耳鳴、頭暈頭痛、頸項(xiàng)強(qiáng)直等癥；頂會(huì)穴(敖瑞音博樂(lè)其日)位于兩耳角連線中點(diǎn)，即頭頂正中心，主治：赫依性音啞癥、巴達(dá)干性視力減退、神志不清、癲狂、頭暈頭痛等癥；黑白際穴(哈日查干乃博樂(lè)其日)位于兩乳正中的心窩處，主治：心悸、心前區(qū)不適、夜不安寐等癥。

在前期研究[1-7]中發(fā)現(xiàn)施灸赫依三穴可改善模型大鼠睡眠，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸相關(guān)調(diào)節(jié)因子5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)等神經(jīng)遞質(zhì)及白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等細(xì)胞因子。

據(jù)研究[8]，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GAT)也是HPA軸重要的調(diào)節(jié)因子。GAT不僅參與對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)，同時(shí)也直接參與了對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)。

GAT[9]是一種糖蛋白，位于神經(jīng)元及膠質(zhì)膜上，GAT在腦組織內(nèi)的作用是攝取突觸間隙及細(xì)胞外液的γ-氨基丁酸，從而終止γ-氨基丁酸的抑制作用，即終止或控制睡眠障礙、焦慮抑郁及精神錯(cuò)亂等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生或發(fā)展。相反，GAT表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致γ-氨基丁酸神經(jīng)信號(hào)傳遞，從而導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。GAT分為4種，即GAT-1、GAT-2、GAT-3、GAT-4，其中GAT-1是最主要的神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，GAT-1的動(dòng)態(tài)變化在一定程度上代表了GABA能神經(jīng)元的變化。

本實(shí)驗(yàn)擬用蒙醫(yī)灸療取有效腧穴——赫依三穴，作用于失眠模型大鼠，觀察模型大鼠行為學(xué)變化，運(yùn)用PCR方法，觀察大鼠腦干組織GAT-1的表達(dá)及二三穴組穴配伍后GAT-1的表達(dá)變化，探究灸療在失眠治療中的可能作用機(jī)制及組穴配伍后的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

100只SD實(shí)驗(yàn)大鼠，體重(200±5)g，購(gòu)自沈陽(yáng)市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證-SXSK(遼)2015-0001。

1.2 試劑及儀器

對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)由北京環(huán)亞太克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司提供，TRNzol總RNA提取試劑由天根生化科技(北京)有限公司提供，艾灸貼購(gòu)自蘇州東方艾絨廠，AUW120D型島津電子天平(日本島津)，QL-902型渦旋振蕩儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，ABI7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 模型建立

本實(shí)驗(yàn)采用PCPA造模法[9]，將PCPA用生理鹽水配置成混懸液(45 mg/100 g)。除正常組，其他組腹腔注射PCPA混懸液(1 mg/100 g)，每天8∶00注射1次，連續(xù)注射2天。第一次注射24 h后大鼠已開(kāi)始走動(dòng)舉肢頻繁、對(duì)外界刺激敏感、晝伏夜出節(jié)律消失等睡眠障礙癥狀。

2.2 選穴依據(jù)與原則

選穴：依據(jù)《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)(蒙醫(yī)學(xué))》[10]及《蒙醫(yī)實(shí)驗(yàn)療術(shù)學(xué)》[11]取有效腧穴——赫依三穴，即頂會(huì)穴、赫依穴、黑白際穴。

2.3 分組及干預(yù)方法

將100只SD大鼠隨機(jī)分為10組，即正常對(duì)照組、模型組、安定組(陽(yáng)性對(duì)照組)、單穴組(頂會(huì)穴組、赫依穴組、黑白際穴組)，二三穴組(頂會(huì)穴與赫依穴組、頂會(huì)穴與黑白際穴組、赫依穴與黑白際穴組、三穴組)，每組10只。 正常組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液(1 mL/100 g)，每日1次，連續(xù)2日注射；第三天開(kāi)始每天抓取、固定1次，不做其他處理，連續(xù)7天。模型組：第三天開(kāi)始每天抓取、固定1次，不做其他處理，連續(xù)7天。安定組：第三天開(kāi)始，每日1次灌胃安定(地西泮)注射液，0.92 mg/kg，連續(xù)7天。頂會(huì)穴組：第三天開(kāi)始，施灸大鼠“頂會(huì)穴”，每日1次，每次施灸5 min(約三個(gè)艾灸貼)，連續(xù)7天。赫依穴組：第三天開(kāi)始，施灸大鼠“赫依穴”，每日1次，每次5 min，連續(xù)7天。黑白際穴組：第三天開(kāi)始，施灸大鼠“黑白際穴”，每日1次，每次5 min，連續(xù)7天。頂會(huì)穴與赫依穴組：第三天開(kāi)始，同時(shí)施灸頂會(huì)穴與赫依穴，每日施灸1次，每次5 min，連續(xù)7天。頂會(huì)穴與黑白際穴組：第三天開(kāi)始，同時(shí)施灸頂會(huì)穴與黑白際穴，每日施灸1次，每次5 min，連續(xù)7天。赫依穴與黑白際穴組：第三天開(kāi)始，同時(shí)施灸赫依穴與黑白際穴，每日施灸1次，每次5 min，連續(xù)7天。三穴組：第三天開(kāi)始，同時(shí)施灸頂會(huì)穴、赫依穴與黑白際穴，每日施灸1次，每次5 min，連續(xù)7天。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

取大鼠腦干組織，放入液氮罐中冷凍，再存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中備用。選取GAT-1引物序列；腦組織置入1 mLTrizol中加入0.2 mL氯仿，室溫孵育10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上層液，加入等體積異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，4 ℃12 000 r/min離心10 min，沉淀物通過(guò)DEPC水洗滌后，提取出腦組織總RNA。將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、照相，用半定量分析凝膠成像系統(tǒng)軟件測(cè)定各電泳帶光密度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2.6.1 蒙醫(yī)灸療法對(duì)SD大鼠腦組織中GAT-1的影響 ①與正常組相比，模型組腦干GAT-1含量降低，差異有顯著性(P<0.05)；②與模型組相比，安定組及各治療組GAT-1含量更降低，差異有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 蒙醫(yī)灸療法對(duì)SD大鼠腦組織中GAT-1的影響

注：圖中數(shù)字1代表正常組，數(shù)字2代表模型組，數(shù)字3代表安定組，數(shù)字4代表赫依組，數(shù)字5代表頂會(huì)，數(shù)字6代表黑白際組GAT-1含量。

2.6.2 二三穴組穴配伍后蒙醫(yī)灸療對(duì)模型大鼠腦干組織中GAT-1含量的影響 與模型組相比，各治療組GAT-1含量更降低，差異有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 組穴配伍后蒙醫(yī)灸療法對(duì)模型大鼠腦干組織中GAT-1的影響

注：圖中數(shù)字1、2代表正常組，數(shù)字3、4代表模型組，數(shù)字5、6代表安定組，數(shù)字7、8代表赫依頂會(huì)組，數(shù)字9、10代表黑白際頂會(huì)穴組，數(shù)字11、12代表赫依黑白際穴組，數(shù)字13、14代表三穴組GAT-1含量。

3 討論

蒙醫(yī)學(xué)中三根(赫依、希拉、巴達(dá)干)是生命活動(dòng)的三種能量和基本物質(zhì)，三根互相制約，互相依存，保持機(jī)體的平衡。三根失去平衡是引起疾病最根本的原因，其中赫依既是一切疾病的前導(dǎo)，也是一切疾病的末尾[10-12]。人體在飲食(過(guò)量進(jìn)食味苦、性輕食物)、起居(起居陰涼)、氣候(長(zhǎng)期冷風(fēng)吹襲)、其他(驚嚇)等四個(gè)發(fā)病條件的作用下，赫依偏勝，三根失去平衡，氣血紊亂累及心臟與白脈，從而引起失眠，因此，大多屬赫依病范疇。而蒙醫(yī)灸療法則是鎮(zhèn)赫依之邪，抑制赫依病擴(kuò)散、醒腦開(kāi)竅之良方[13]。蒙醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作《甘露四部》[14]中記載：“赫依增多則出現(xiàn)身體黑瘦、喜暖、頭暈、失眠，體力衰弱……”“赫依偏盛引起的疾病以敖瑞音博樂(lè)其日、赫依音博樂(lè)其日、哈日查干乃博樂(lè)其日灸之……”。 臨床中，在頂會(huì)穴、赫依穴、黑白際穴等穴位上施灸，可治療心煩易怒、心悸、失眠等各種赫依性病癥。而且施灸單穴或施灸二三穴配伍治療均具有抗失眠的療效。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于哺乳動(dòng)物樞神經(jīng)系統(tǒng)中[15-16]。GABA神經(jīng)元興奮時(shí)，GABA被神經(jīng)末梢釋放到突觸間隙，并通過(guò)與位于突觸后膜的GABA受體結(jié)合發(fā)揮作用。終止遞質(zhì)的作用主要依賴位于突觸前膜和膠質(zhì)細(xì)胞膜的GAT對(duì)突觸間隙內(nèi)的GABA的攝取功能。GAT對(duì)已釋放的GABA的攝取作用能有效控制突觸間隙GABA濃度及潴留時(shí)間，從而調(diào)控GABA神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，防止神經(jīng)細(xì)胞過(guò)于興奮，調(diào)理睡眠。

據(jù)研究[8-9]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，如睡眠障礙、焦慮、抑郁及各種輕中重度疼痛都與 GABA的抑制性突觸傳遞作用有密切關(guān)系，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白功能，可作為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法。研究證明GAT-1是最主要的神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，GAT-1的動(dòng)態(tài)變化在一定程度上代表了GABA能神經(jīng)元的變化，在實(shí)驗(yàn)中可作為觀察指標(biāo)。

該實(shí)驗(yàn)中，大鼠腹腔注射PCPA后 24 h開(kāi)始出現(xiàn)走動(dòng)次數(shù)明顯，舉肢、不能安臥等外部特征。安定組與各灸療組開(kāi)始干預(yù)后大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，整體觀察與模型組不同，GAT-1的表達(dá)也較模型組下降，表示安定組與灸療組改善了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的失眠癥狀。推測(cè)赫依三穴在單穴治療和組穴配伍后的治療中，對(duì)PCR法檢測(cè)的GAT-1的表達(dá)有著共同的降低調(diào)節(jié)作用。從RNA水平證實(shí)了蒙醫(yī)灸療鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制，證實(shí)了施灸赫依三穴在單穴治療和組穴配伍治療中均有鎮(zhèn)靜催眠作用。