基于網絡藥理學探討淫羊藿抗創傷后應激性障礙的作用機制研究

仇志坤,馬建春,吳紅衛,陳永,楊澤民,陳吉生,劉志挺

(1.廣東藥科大學附屬第一醫院臨床藥學科，廣東 廣州 510080; 2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

創傷后應激性障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)是一種當個體經歷嚴重創傷或者威脅情況后所產生的具有持續存在的精神性障礙[1-2]。隨著近年來出現的自然災害爆發、戰爭、暴力沖突等突發事件的增多，PTSD的發病有增多的趨勢[3-4]。PTSD患者的癥狀主要有對創傷相關線索和事件的病理性重現和回避，并可能伴有選擇性的遺忘和持續性的高喚醒。該精神障礙對社會和個人均造成沉重的負擔，其具有慢性化、病程長、群體發病率高和臨床療效不足等特點[5-6]。因此，PTSD患者的生活質量和防治備受關注。研究顯示神經遞質水平、炎癥因子調節的紊亂或神經類固醇水平等內分泌信號通路的紊亂可能是PTSD的發病起因[7-8]。這些生物功能的變化可能導致患者大腦出現功能的異常，比如闖入性再體現或過度警覺等，往往與臨床上PTSD的癥狀密切關聯。

鑒于PTSD發病機制的復雜性和多變性，臨床上尚缺乏其特異性藥物。部分抗精神病藥物，如抗抑郁藥中的5羥色胺再攝取抑制劑 (selective serotonin reuptake inhibitor,SSRIs) 是臨床上用于防治PTSD的常用藥物，代表藥物有帕羅西汀和舍曲林[9-10]。其作用機制是通過調節PTSD患者中腦區中5羥色胺水平產生抗PTSD的藥理效應。然而，該類藥物的抗PTSD藥效僅屬于擴大適應癥治療，且臨床應用價值尚未確切。同時，SSRIs在臨床上防治PTSD須慎重考慮，其原因是該類藥物起效慢，有效率不高，且可導致使用者患有自殺等毒副作用[11-12]。據此，繼續深挖PTSD的發病機制，對尋找高效和低毒的抗PTSD藥物具有研究意義。

由于臨床上應用抗PTSD藥物所存在的不足，中藥在該防治領域的應用也越來越受到關注。淫羊藿 (epimedium) 又稱三枝九葉草或仙靈脾，是一種多年生草本植物。中醫記載其味甘、辛、溫、歸腎、肝經，具有祛風除濕、強筋骨和補腎壯陽的功效[13-14]。藥理學研究顯示淫羊藿具有抗骨質疏松、抗腫瘤、抗炎、免疫調節、抗氧化、調節內分泌系統等作用[15-16]。近年來，淫羊藿在防治神經精神障礙中的研究備受關注。研究顯示淫羊藿具有抗抑郁、抗應激、改善腦供血等藥理效應[15,17-18]。然而，尚未有報道關于淫羊藿防治PTSD的作用。

PTSD與機體受到應激后產生情緒變化密切相關[18]。從中醫辯證的角度進行分析，PTSD的致病與內因密切相關。內因方面主要是素體稟賦不足而致臟腑功能失調，病機與腎陽不足和肝氣郁結相關。機體長期處于驚恐失調狀態，驚則氣亂、遍生諸癥；恐則氣下，腎精腎氣受損，不得主生殖發育和封藏。《神農本草經》提及淫羊藿具有“強志”的功效，可治“中年健忘，老人昏耄”。《醫學入門》則敘述淫羊藿可補腎虛和助陽，同時，淫羊藿的功效如同太陽，可補命門之火[19-21]。結合上述淫羊藿在防治神經精神障礙中的作用，推測淫羊藿可能具有抗PTSD效應。

目前，中藥的研究已逐步從單一成分或靶點的研究模式逐步轉向為多種活性成分和網絡靶點映射的研究新模式。其代表的研究方法網絡藥理學為中醫藥從經驗醫學逐步轉變為循證藥學或精準藥學的新途徑[22-23]。本研究嘗試采用網絡藥理學的分析方法，通過藥物-活性成分-靶點-疾病構建網絡，并結合相關靶點基因本體 (gene ontology,GO) 生物學分子功能分析和京都基因與基因組百科全書 (kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 基因作用信號通路富集分析探討淫羊藿有效成分的潛在作用靶點、作用信號通路及生物分子功能等信息，多角度推測其防治PTSD的機制和可行性。

1 方法

1.1 淫羊藿活性成分和作用靶點篩選

淫羊藿活性成分和作用靶點的篩選主要是通過文獻[24-26]和的經典數據庫數據收集得到。研究采用中藥數據庫為Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP,http:∥tcmspw.com/) 和A Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine(BATMAN-TCM,http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。以“淫羊藿”為搜索關鍵詞，得到淫羊藿的候選成分。進一步以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-like,DL)為篩選參數，得到淫羊藿較高活性的成分。根據文獻報道，2個參數的篩選條件為：OB≥30%和DL≥0.18[27]。

篩選活性成分后，在數據庫中獲取活性成分對應的靶點蛋白，并在蛋白質數據庫UniProt (http:∥www.uniprot.org/uploadlists/) 標準化基因名稱。Cytoscape3.7.2構建淫羊藿活性成分-靶點基因網絡關系圖。在輸出結果中，以不同顏色的節點分別表示淫羊藿活性成分和靶點基因。兩者通過連線相連表示其相關性，并展開拓撲學屬性分析。

1.2 PTSD致病相關基因信息收集

PTSD致病相關基因信息收集也是主要通過常用數據庫數據收集。研究通過經典數據庫為Genecards (https:∥www.genecards.org) 和 Thera-peutic Target Database (TTD,https: ∥db.Idrblab.org/ttd/) 。以"post traumatic stress disorder”或"PTSD”為搜索關鍵詞，得到PTSD發病相關蛋白信息。在數據庫中獲取對應蛋白信息后，通過UniProt數據庫標準化基因名稱。Cytoscape3.7.2構建PTSD-靶點基因的網絡關系圖，在輸出結果中，以不同顏色的節點分別表示疾病和相關基因。兩者通過連線相連表示其相關性，并進行拓撲學屬性分析。

1.3 淫羊藿活性成分作用靶點與PTSD致病相關基因交集分析

在完成淫羊藿活性成分作用靶點和PTSD致病相關基因信息收集和篩選的基礎上，研究嘗試把淫羊藿活性成分作用靶點和PTSD致病相關基因取交集，得出淫羊藿抗PTSD藥理效應可能的作用靶點基因。研究采用網絡分析軟件Venny2.1.0 (https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) 交集映射。通過輸入相關基因，最終得到交集映射基因和韋恩圖。

1.4 淫羊藿-活性成分-靶點基因-PTSD的關系網絡構建

在完成淫羊藿活性成分作用靶點和PTSD致病相關基因交集映射基礎上，嘗試把淫羊藿-活性成分-交集靶點基因-PTSD等元素歸集并構建關系網絡，以探討淫羊藿抗PTSD的作用機制。通過交集的基因，進一步篩選得到與PTSD致病相關的淫羊藿活性成分。繼續采用Cytoscape3.7.2中繪制淫羊藿-活性成分-靶點基因-PTSD關系網絡圖。在完成可視化關系網絡構建后，繼續采用軟件中“Network Analyzer”功能分析關系網絡中的拓撲學屬性。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)關系網絡的構建

在構建淫羊藿-活性成分-靶點基因-PTSD的關系網絡的基礎上，研究進一步探討這些靶點之間的相互作用和關系。實驗將篩選的靶點導入STRING網絡平臺 (https:∥string-db.org/) 中構建靶點相互作用網絡關系圖 (protein-protein interaction,PPI)。把蛋白種類設置為“Homo sapiens”(即分析物種為人類)，根據STRING網絡平臺設定的參數，將評分條件 (置信度) 設定>0.4，采用R3.6.3軟件和Cytoscape3.7.2對蛋白的自由度進行分析和統計，探討淫羊藿防治PTSD的核心靶點的相互關系。

1.6 GO生物學分子功能富集分析

研究嘗試探討核心靶點基因富集的生物學分析功能，采用R語言3.6.3軟件中的“clusterProfiler”、“DOSE”、“org.Hs.eg.db”、“stringi”等數據包在GO生物學分子功能方面進行富集分析和可視化處理，以P<0.05進行人類生物分子功能富集分析，并統計富集的結果。

1.7 KEGG基因作用信號通路富集分析

研究嘗試通過KEGG分析探討核心靶點基因富集的作用信號通路。根據文獻的方法學提示，本研究采用R語言3.6.3軟件中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“DOSE”、“stringi”等數據包在KEGG作用信號通路富集分析和可視化處理，以P<0.05進行人類作用信號通路富集分析，并統計富集的結果。

1.8 作用靶點富集信號通路圖分析

選取KEGG分析中核心的富集信號通路進行分析，以探討淫羊藿抗PTSD潛在的作用機制。實驗采用R語言3.6.3軟件中的“org.Hs.eg.db”、“pathview”、 “stringi”等數據包檢索靶點基因作用在KEGG富集信號通路上的通路圖，并將主要靶點基因在主要富集信號通路上標記，以圖視化淫羊藿的藥理效應是通過多靶點、多途徑產生的。

2 結果

2.1 淫羊藿活性成分和作用靶點篩選結果

根據文獻的檢索，并結合TCMSP和BATMAN-TCM兩個數據庫的數據共收集到淫羊藿的成分144個。根據OB (≥30%) 和DL (≥0.18) 2個參數篩選，得到淫羊藿活性成分24個，結果如表1所示。這些活性成分中，主要有甾體類、苷類、黃酮醇類、黃酮類等化合物。在以上24個活性成分中，作用人類靶點蛋白的活性成分共21個，對應靶點基因188個，結果如圖1所示。

表1 淫羊藿活性成分基本信息

Cytoscape3.7.2拓撲分析網絡關系相關指標如下：節點209個，其中活性成分節點21個，相關靶點基因節點188個。網絡密度0.018，網絡集中度0.637，網絡異質性為2.925，最短路徑為43 472。最大自由度和介數中心度存在于活性成分quercetin，分別為136和0.709 107 06。

紅色長方形：淫羊藿活性成分； 綠色八邊形：靶點基因。

2.2 PTSD致病相關基因收集結果

根據數據庫的檢索，結合Genecards和TTD兩個數據庫的數據共收集人類PTSD致病相關基因210個，結果如圖2所示。Cytoscape3.7.2拓撲分析顯示網絡相關指標如下：節點有211個，其中疾病節點1個，致病相關基因節點210個。網絡集中度為1，網絡密度為0.009，網絡異質性為7.211，最短路徑為44 310。最大自由度和介數中心度存在于疾病PTSD，分別為210和1。

2.3 淫羊藿活性成分作用靶點與PTSD致病相關基因交集結果

如圖3顯示，根據Venny2.1分析和統計結果，在淫羊藿活性成分作用靶點(188個)和PTSD致病相關基因(210)個中，交集映射的基因有30個。這些基因分別為：NOS2、ESR1、NR3C2、ACHE、SLC6A2、HMOX1、ADRB2、HTR3A、ADRA2B、SLC6A3、SLC6A4、DRD2、OPRM1、IL10、IL6、APP、IL2、IFNG、IL4、MAOB、FOS、SOD1、PRKCA、IL1B、CCL2、CXCL8、SERPINE1、IL1A、CRP、CXCL10。交集基因數目占總基因數目的8.2%。

綠色橢圓形： PTSD；藍色六邊形：致病相關基因。

圖3 淫羊藿活性成分作用靶點與PTSD致病相關基因交集映射

2.4 淫羊藿-活性成分-靶點基因-PTSD的網絡關系構建結果

淫羊藿-活性成分-靶點基因-PTSD的網絡關系構建結果如圖4所示。Cytoscape3.7.2拓撲分析網絡中共有46個節點。其中藥物節點1個，活性成分節點14個，靶點基因節點30個，疾病節點1個。其中關聯邊103條，節點平均自由度為4.478。網絡集中度為0.593，網絡密度為0.1，網絡異質性為1.126，最短路徑為2 070。關系網絡中節點的度值和介值中心度是體現網絡節點重要性的指標。圖4顯示節點的平均度值為4.478，大于該平均度值的節點有12個；節點平均介值中心度為0.028，大于該平均介值中心度的節點有12個。共有12個節點的度值和介值中心度均高于均值(見表2)，其中包括藥物1個，疾病1個，活性成分6個，相關靶點基因11個。化合物分別為quercetin、C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)-、luteolin、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone、kaempferol、Anhydroicaritin。在這些化合物中，主要分類為黃酮類和苷類。靶點基因分別是ESR1、ACHE、NOS2、ADRB2。

綠色八邊形：淫羊藿；藍色六邊形：活性成分；紅色四邊形：PTSD；黃色橢圓形：作用靶點。

2.5 PPI網絡的構建結果

為探討淫羊藿抗PTSD的潛在作用機制，研究將淫羊藿活性成分作用靶點基因和PTSD致病相關基因交集映射的30個靶點基因導入STRING數據庫構建PPI網絡。如圖5A所示，該網絡共有30個節點，相互作用關系194條，平均度值為12.9。將PPI網絡數據導入R語言3.6.3軟件中，蛋白的度數由高到低排序。篩選出大于平均度值的核心靶點蛋白18個，分別是IL-6、FOS、IL-1B、CXCL8、IL-10、CXCL10、CCL2、APP、SERPINE1、OPRM1、IL-4、HMOX1、IFNG、CRP、NOS2、IL-2、IL-1A、ACHE (圖5B)。實驗結果提示這18個靶點蛋白是PPI網絡中的關鍵靶點，淫羊藿抗PTSD的潛在藥理作用可能是通過作用于這些靶點得以發揮。

表2 淫羊藿-活性成分-作用靶點-PTSD網絡關鍵節點及拓撲學特征

2.6 相關靶點基因GO生物學分子功能分析

根據前期分析，將淫羊藿活性成分靶點基因和PTSD致病相關基因中30個交集映射基因進行GO生物學分子功能分析。圖6和圖7顯示篩選得與交集映射基因顯著相關的生物學分子功能共42種(P<0.05)。其中，受到細胞因子的活性和受體的結合程度分子功能影響的基因數目各為33.33%。其次，生長因子受體的結合和銨離子的結合也是影響基因分子功能的重要因素，參與以上2種分子功能的基因數目分別為20%和16.67%。此外，也有部分基因參與到兒茶酚胺 (13.33%)、神經遞質(13.33%)、生長因素 (13.33%) 的活性等生物分子功能的調節中。結果提示淫羊藿抗PTSD的潛在作用機制與多種生物分子功能有關，其中主要影響因素有細胞因子、受體結合活性、銨離子的結合，兒茶酚胺、神經遞質、生長因素等。

2.7 KEGG作用信號通路富集分析結果

根據前期分析，將淫羊藿活性成分靶點基因和PTSD致病相關基因中30個交集映射基因進行KEGG作用信號通路富集分析。圖8和圖9顯示篩選得與交集映射基因顯著相關的作用信號通路共57條 (P<0.05)。從作用信號通路富集上分析主要與細胞因子與細胞因子受體的相互作用的信號通路 (34.48%) 和美國錐蟲病相關信號通路 (34.48%) 相關。其次，白介素17和A型流感疾病相關信號通路也是重要的影響因素，在以上2種作用信號通路的相關基因的均為27.59%。此外，也有部分基因富集在炎癥性腸病相關信號通路、百日咳相關信號通路、黑熱病相關信號通路、類風濕性關節炎相關信號通路、阿米巴病相關信號通路、糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路。富集在以上6種作用信號通路的相關基因的均為24.14%。結果提示相關基因共同參與調節信號通路較多，發揮抗炎、抗病毒、免疫調節等作用，可能是淫羊藿抗PTSD的潛在機制。

A. PPI網絡圖； B.度數排序。

圖5淫羊藿抗PTSD發病相關靶點蛋白的PPI網絡圖和度數排序
Figure5PPI network diagram and degree ordering of target proteins of epimedium against PTSD

圖6 GO生物分子功能分析Figure 6 GO analysis of biomolecular function

圖7 GO生物分子功能分析 (基因比例)Figure 7 GO analysis of biomolecular function (gene ratio)

2.8 淫羊藿抗PTSD的作用信號通路圖結果

結合圖9和圖10的實驗結果，研究選取相關核心靶點基因主要富集的作用信號通路，如細胞因子受體的相互作用的富集信號通路 (圖10)，美國錐蟲病的富集信號通路 (圖11) 和白介素17富集信號通路 (圖12)。圖中相關靶點基因已用紅色所以標記。結果顯示IL-2、IL-8、CXCL2、CXCL10等基因與細胞免疫和炎癥調節作用密切相關。信號通路圖結果提示淫羊藿抗PTSD的作用靶點可能是通過細胞免疫和炎癥調節過程產生藥效。

3 討論

本研究主要探討和推測淫羊藿抗PTSD的可行性和潛在的作用機制。文獻檢索和TCMSP和BATMAN-TCM數據庫搜索和篩選得淫羊藿活性成分21個。目前，部分研究關于PTSD的致病與免疫系統功能的調節[28-29]。PTSD的發病可引起機體免疫功能調節的異常，但具體機制尚未完全清楚。近年研究表明，促炎性細胞因子水平的變化可能是PTSD潛在的發病機制之一[30-31]。PTSD患者免疫系統功能可產生異常，炎癥反應增強，如患者血清中IL-6、IL-10和IL-1B等免疫因子的水平顯著性提高[32-33]，提示PTSD患者可能存在免疫系統的激活，導致神經炎癥的產生[30-33]。在恐懼記憶恢復后IL-6的釋放可維持恐懼記憶。這些發現進一步加深對炎癥因子在PTSD發病中作用，并提示IL-6和其他促炎細胞因子可能維持PTSD患者恐懼記憶，這并不能使恐懼記憶消失[34]。

圖8 KEGG作用信號通路富集分析

圖9 KEGG作用信號通路富集分析 (基因比例)Figure 9 KEGG analysis of action signal pathway concentration (gene ratio)

圖10 淫羊藿活性成分在細胞因子受體的相互作用的富集信號通路中標注圖Figure 10 Enrichment of the active components of epimedium on the interaction of cytokine receptor signaling pathways

圖11 淫羊藿活性成分在美國錐蟲病的富集信號通路中標注圖Figure 11 Enrichment of the active components of epimedium in the American Chagas disease

圖12 淫羊藿活性成分在白介素17的富集信號通路中標注圖Figure 12 Enrichment of the active components of epimedium in the signaling pathway of interleukin 17

此外，文獻也報道PTSD的致病與IL-1B的調節密切關聯。如IL-1B中rs16944和rs1143633單核苷酸與PTSD的發病呈負相關。結果顯示與對照組相比，PTSD患者的IL-1B中rs1143633*C和rs16944*A等位基因頻率和攜帶率顯著下降[35]。再者，細胞凋亡也參與PTSD的致病機理[36]。FOS蛋白被認為具有細胞增殖、分化和轉化的調節作用[37]。FOS基因家族由以下蛋白組成，分別是FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2[38-39]。其相關的基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白，與Jun家族蛋白質構建二聚體，形成轉錄因子復合物AP-1[39]。因此，FOS基因/蛋白的表達與凋亡細胞死亡有關，已有報道FOS基因/蛋白的表達與PTSD的致病相關，與本研究中FOS蛋白作為PTSD發病的核心靶點蛋白一致。

進一步探索以上的靶點基因所富集的分子生物學功能和所在的富集信號通路，研究采用GO富集分析 和KEGG富集分析。實驗結果提示細胞因子的活性和受體的結合程度的富集是核心靶點基因分子功能的主要影響因素。結合上述炎癥因子在PTSD發病中的重要性，推測細胞因子中炎癥因子及其與受體的結合程度是影響PTSD發病的關鍵，神經遞質、生長因素、兒茶酚胺等生物因素也參與到PTSD的發病機制中。以上因素已有相關文獻報道可從不同方面影響PTSD的病程進展，如神經遞質中5羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺等水平的紊亂均是PTSD發病的重要影響因素[40-41]。在KEGG富集研究中，細胞因子之間受體的相互作用和白介素17通路是相關核心作用靶點主要富集的信號通路。這些信號通路富集多種炎癥因子和趨化因子，并與其調控密切相關。其中在白介素17信號通路上富集的相關基因如AP-1、IL-4、IL-6、CXCL13等免疫相關的細胞因子，這些細胞因子成為影響白介素17信號通路上的重要因素，并影響PTSD的發病。本研究還發現在美國錐蟲病的信號通路中多個相關基因與本研究中核心靶點相關，其中包括IL-10、IL-6等。這些基因均涉及免疫機體功能的調節。從GO富集分析和KEGG富集分析等研究的結果提示，淫羊藿抗PTSD的潛在藥理效應與調節免疫系統中炎癥因子的水平和表達關系密切。

本研究僅對網絡數據挖掘的資料進行分析后推測淫羊藿抗PTSD的潛在作用機制，其意義在于給實驗研究方向性。研究分析得涉及多種分子功能和多條作用通路。然而，以上結果尚需實驗驗證，如動物實驗、分子生物學實驗等。在研究淫羊藿抗PTSD效應中，動物實驗可添加以上推測基因/蛋白的相關拮抗劑以驗證該藥理效應是否與所拮抗的基因/蛋白相關；在細胞水平探討中，可上(下)調推測基因/蛋白以評價該藥理效應是否與相應的基因/蛋白相關。據此，仍需通過相關的實驗驗證以上的推測。

綜上，研究通過網絡藥理學的方法發現淫羊藿中多個活性成分可作用于同一靶點，單個活性成分也可以作用于多個靶點，并通過多條信號通路共同發揮藥理效應。這體現出中藥多成分、多靶點、多通路的整體調節作用特點。其活性成分能通過信號傳導通路而起到抗PTSD的作用，對淫羊藿從基因蛋白層面推測其防治PTSD機制和可行性具有重要意義。