骨碎補馬鹿茸片毒理學安全性評價

錢星文， 伍小妹， 譚轉換

(東方藥林藥業有限公司，廣東 廣州 510515)

骨質疏松癥(OP)是一種骨骼系統疾病，多由骨量減少、骨骼微細結構破壞、骨骼脆性增加、易于骨折等原因引起[1]。在人口壽命延長、老年人口占比必然上升的情況下[2]，OP成為繼心血管疾病、糖尿病之后的第3種常見多發的慢性疾病[3]，已成為一個全球性的問題[4]。本文研究一種具有增加骨密度作用的中藥保健食品，來源于南方醫科大學的名醫驗方，主要用于增強骨密度，方中所用原料均在既是食品又是藥品的保健品名單中[5]，本實驗擬對東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片進行毒理學實驗，進一步研究東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片的安全性，為組方的安全使用提供依據。

1 材料和試劑

1.1 實驗樣品

東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片(中元片)，由淫羊藿、骨碎補、山茱萸、馬鹿茸為原料，添加微晶纖維素、淀粉、硬脂酸鎂、潤濕劑聚維酮 K30制備而成，每日服用量為4.32 g/60 kg(體質量，下同)，送檢樣品量為5.0 kg(為中試驗證生產中的未添加輔料的中間產品，批號為20170503)，棕色粉末，相當于成品樣品9.72 kg，樣品每日服用劑量為2.22 g/60 kg，東方藥林藥業有限公司提供。

1.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠和Wistar大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK(京)2016-0011。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學規定。

1.3 儀器和試劑

XS6001S動物秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GR85DA高壓滅菌鍋[致微(廈門)儀器有限公司]；TC20細胞計數儀(美國BIO-RAD公司)；VS-1300L-U超凈工作臺(蘇州安泰公司)；SPX-250智能生化培養箱(金壇市醫療儀器廠)、OLYMPUS 顯微鏡(OLYMPUS公司)；AU480 全自動生化分析儀(Beckmen Coulter公司)； XT-2000i五分類血球計數儀(Sysmex公司)。

1.4 方法[6]

1.4.1 小鼠經口急性毒性實驗(最大耐受量法，MTD法) 選用雌雄各半20只18～22 g SPF級昆明種小鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的劑量，給予質量濃度為0.375 g/mL、灌胃量為0.20 mL/10 g的樣品溶液2次，時間間隔為6 h，給藥后連續觀察14 d。記錄中毒表現及死亡情況。

1.4.2 大鼠經口急性毒性實驗(最大耐受量法) 選用雌雄各半20只180～220 g SPF級Wistar大鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的劑量，給予質量濃度為0.375 g/mL、灌胃量為2.0 mL/100 g的樣品溶液2次，時間間隔為6 h，給藥后連續觀察14 d。記錄中毒表現及死亡情況，判斷受試物的急性毒性。

1.4.3 Ames實驗 采用經鑒定符合要求的鼠傷害沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗菌株進行實驗。用多氯聯苯(PCB)誘導大鼠后制備的肝勻漿(S9)作為體外代謝活化系統。受試物質量濃度分別為50、10、2、0.4、0.08 mg/mL。實驗設0、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿6個劑量組和陽性對照組。在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL受試物和0.5 mL S9混合液(當需要代謝活化時)，混勻后倒入底層培養基平板上，每組均做3個平行樣。37 ℃培養48 h，計數每皿回變菌落數。若受試物的回變菌落數是空白對照菌落數2倍以上、具有劑量-反應關系者，判定為陽性。整套實驗在相同條件下重復進行1次。

1.4.4 小鼠骨髓細胞微核實驗 采用間隔24 h 2次灌胃法進行實驗。用雌雄各半的50只體質量25～30 g小鼠，隨機分為5組，每組10只，以40 mg/kg劑量的環磷酰胺作為陽性對照，腹腔注射給藥，給藥量為0.1 mL/10 g。實驗組樣品劑量設定為0、2.5、5.0、7.5 g/kg，稱取樣品加蒸餾水調配成濃度分別為0、0.125、0.250、0.375 g/mL的樣品溶液，灌胃量為0.2 mL/10 g。于末次給樣品溶液6 h后，頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學顯微鏡下，每只動物計算1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，微核發生率以含微核的PCE千分率計，并用泊松分布方法進行數據統計，并計算PCE/NCE(成熟紅細胞)比例。

1.4.5 小鼠睪丸染色體畸變實驗 用25只體質量25～30 g的性成熟小鼠，隨機分成5組，每組5只，陽性對照組給予2.0 mg/kg劑量的絲裂霉素，給藥量為0.1 mL/10 g，每天腹腔注射給藥1次，連續2 d。實驗組樣品劑量設定為0、2.5、5.0、7.5 g/kg，取樣品加蒸餾水分別調配成濃度為0、0.125、0.250、0.375 g/mL的樣品溶液，灌胃量均為0.2 mL/10 g，每日灌胃1次，連續5 d，于首次給予受試物后的第13天，5組動物同時腹腔注射給予6 mg/kg劑量的秋水仙素1次，6 h后處死，取雙側睪丸制片，Giemsa染色，每組分析5只動物的染色體，每只動物分析100個中期相細胞，計算睪丸染色體畸變發生率(以百分率計)。

1.4.6 亞急性毒性實驗 選用體質量60～80 g SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，隨機分為3個樣品組及對照品組，每組20只，樣品飼喂劑量設計為：0、0.93、1.85、3.70 g/kg(分別相當于未去除輔料成品人擬用劑量的0倍、25倍、50倍、100倍)，動物單籠喂養，自由飲食。連續30 d觀察實驗動物的一般情況，實驗結束禁食16 h后，處死動物并檢查實驗動物的體質量、血液指標、生化指標以及臟器及胸、腹腔大體病理變化。各組數據均采用SPSS19.0進行統計，方差分析方法進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 經口急性毒性實驗

實驗結果顯示，14 d實驗期內未見明顯的中毒表現和動物死亡，各主要臟器亦未見異常，說明受試物對兩種性別的大、小鼠的經口最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg，根據急性毒性分級，東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片屬無毒類物質。

2.2 Ames實驗

樣品各劑量組回變菌落數均未超過空白對照菌落數2倍；對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株實驗菌株，加與不加S9，回變菌落數均未超過空白對照組菌落數的2倍，Ames實驗中未見劑量-反應關系，實驗結果為陰性，未出現基因突變情況。

2.3 小鼠骨髓細胞微核實驗

由表1可見，樣品各劑量組微核率與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而環磷酰胺組與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片小鼠骨髓細胞微核實驗結果為陰性。

2.4 小鼠睪丸染色體畸變實驗

樣品各劑量組小鼠睪丸染色體畸變發生率均為0，與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而絲裂霉素陽性對照組小鼠睪丸染色體畸變發生率為0.3%，與陰性對照組相比較差異有統計學意義(P<0.05)。說明東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片不會導致小鼠睪丸染色體畸變產生。

2.5 亞急性毒性實驗結果

2.5.1 一般情況觀察 以0.93、1.85、3.70 g/kg的劑量樣品飼料喂飼大鼠30 d期間，動物未出現拒食現象，一般情況表現良好。各組隨機選取10只動物的每周食物利用率、總食物利用率、體質量和增重與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1～圖4。

圖1 實驗期間大鼠的體質量變化

圖2 實驗期間大鼠每周的進食量變化

圖3 實驗期間大鼠每周食物利用率

2.5.2 受試物對大鼠血液學指標的影響 由表2、3可見，實驗末期血液學的各項指標中，僅雌性動物中劑量組紅細胞計數明顯高于對照組(P<0.05)，但均在本檢測單位正常值范圍內。其余各劑量組的各項指標與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5.3 受試物對大鼠生化指標的影響 由表4可見，實驗末期，各劑量組實驗動物的各項生化指標均在本檢測單位正常值范圍內，各項指標與空白對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5.4 受試物對大鼠臟器的影響 受試物各劑量組動物的大體解剖檢查未發現異常和明顯病變，臟器質量及臟體比值與空白對照組比較，差異無統計學意義(表5、6)(P>0.05)。

2.5.5 組織學檢查結果 試驗結束時，對各劑量組實驗動物進行大體檢查，通過鏡下觀察高劑量組與對照組，未發現與樣品相關的病理組織學改變，因此，選擇高劑量組和對照組，進行肝、腎、胃、十二指腸、脾臟、睪丸和卵巢的組織學檢查。個別受檢動物，肝臟匯管區可見少量小圓形炎細胞浸潤(對照組3/20，高劑量組2/20)、腎間質可見少量小圓形炎細胞浸潤(對照組1/20，高劑量組2/20)，但兩組2種病變例數之間無顯著性差異，提示所出現的病變與受試物無關，可能是動物的自發病變。除此之外，胃、十二指腸、脾臟、睪丸和卵巢中均未見異常的病理改變，各劑量組動物臟器均未發現由受試物引起的損害性改變。

圖4 實驗期間大鼠的總增重、總進食量、總食物利用率變化

表2 受試物對大鼠血液學指標的影響Table 2 Effect of test substance on hematological indexes in

表3 受試物對大鼠白細胞分類的影響

表4 受試物對大鼠生化指標的影響Table 4 Effect of test substance on blood biochemical indexes in

表5 受試物對大鼠臟器質量的影響

表6 受試物對大鼠臟體比的影響

3 討論

東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片對2種性別的大、小鼠最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg；3項遺傳毒性實驗結果均為陰性；30 d喂飼試驗期間，各組動物體質量、增重、食物利用率及臟體比值與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；血液學指標、生化指標均在本檢測單位正常值范圍內；大體解剖未發現與受試樣品相關的病理組織學改變。綜上所述，本產品對大、小鼠細胞內的遺傳物質無致突變作用、無遺傳毒性和亞急性毒性，根據國家衛生部相關分級標準判斷，東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片屬于無毒級，是一種食用安全的保健食品。

骨碎補馬鹿茸片以淫羊藿、骨碎補、山茱萸、馬鹿茸四味經典的補腎中藥材為主要原料，研究發現，補腎中藥具有促進成骨細胞的骨形成、抑制碎骨細胞的骨吸收的作用，能通過多種途徑防治骨質疏松癥[7]。方中淫羊藿主要含有淫羊藿苷、總黃酮等生物活性成分[8]；淫羊藿治療股骨頭壞死具有多成分、多靶點的特點，其主要通路不僅直接參與骨重建的細胞增殖、凋亡及分化，調節成骨、破骨代謝平衡，還通過調節免疫、炎癥及應激反應等干預和影響骨微環境以達到控制疾病發生發展的目的，與目前治療股骨頭壞死的作用機制相符合[9]。補骨脂活性成分主要有香豆素類、黃酮類、萜酚類等，是抗骨質疏松的主要活性物質，具有促進成骨細胞的分化、增殖，促進骨形成的作用[10-11]。山茱萸的現代研究顯示，山茱萸總苷可調節骨質疏松大鼠骨組織TRPV6、TRPV5、通道蛋白表達，改變TRPV6/TRPV5倍比關系，影響成骨細胞和破骨細胞功能，促進成骨方向的骨代謝轉變及提高骨密度[12]。鹿茸具有骨生長因子，能促進傷口愈合、組織修復，可能對股骨頭缺血性壞死具有治療作用，現代實驗研究結果提示鹿茸粉能通過增加骨形成、改善脂肪代謝和增加血管形成來治療激素誘導性股骨頭壞死[13]。以上內容提示本產品具有改善骨質疏松癥、增強骨密度的作用，本產品的研發順應了人口老齡化的加劇、骨質疏松癥多發的社會問題現狀，和如今社會對骨質疏松癥的高度重視、藥物治療可能引起嚴重副作用、價格高等問題，通過合理地攝入增強骨密度功能食品來預防和延緩骨質疏松的發生和發展、促進人體健康必不可少，可見本產品具有良好的開發前景，本研究也進一步證實了產品的安全性，為本產品的增強骨密度的功效及作用研究提供良好基礎，加速其研發速度，以降低骨質疏松的發生和發展。本產品的研發理念為針對男女生理構造和需要的不同而研發出男性專用的中元片和女性專用的欣月片，而要更好地確定本產品在增加骨密度、預防骨質疏松發生的作用靶點和對男女之間是否存在明顯區別，還需要更深入的研究和探索，為產品的更好應用提供證據。