基于UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析定心方Ⅳ號化學成分

任妍，陳嘉慧，張雅心，劉孟華，鄒威，何盈，饒文婷，黃凱，周鳳華

(1.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515； 2.南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510515； 3.湖南省婦幼保健院，湖南 長沙 410008)

《素問·痹論》中“脈者，血之府也，澀則心痛。”可見，冠心病是由于病邪久留于心以致瘀血，使得血行不暢、心脈失養，進而導致津痰凝結、氣滯血瘀，最終心脈癥積而成[1]。針對冠心病瘀毒致變的基本病機，本課題組確立從心論治冠心病的治療思想，選取南方醫院臨床效驗方定心方(Dingxin Recipe，DXR)中主入心經的黃連、丹參、酸棗仁及靈芝四味藥材，組成定心方Ⅳ號，共奏清熱解毒、益氣活血功效。動物實驗發現，定心方Ⅳ號能有效調控動脈粥樣硬化小鼠血脂水平，延緩斑塊進展，但其發揮藥效的成分不清楚[2]。因此，本研究采用靈敏準確的超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術，首次鑒定了定心方Ⅳ號的化學成分，尋找其發揮作用的藥效物質基礎，以期為后續藥理機制研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型高效液相色譜儀-6550Q/TOF-MS/MS(美國Agilent科技公司)；Qualitative Analysis質譜分析軟件以及MassHunter 色譜工作站；EYELA N-1001型旋轉蒸發儀(埃郎科技國際貿易上海有限公司)；BT25S型電子分析天平(廣州計量檢測技術研究院檢定合格，編號20080775)及ELGA ClassicUV超純水系統。

1.2 藥材與試劑

丹參飲片(廣西玉林有田藥業有限公司，批號180701)；黃連片(廣東大翔藥業有限公司，識別號187HX18D01)；酸棗仁片(廣東大翔藥業有限公司，批號BJHX18F01)；靈芝片(廣東大翔藥業有限公司，批號187HX18D01)，飲片由南方醫科大學中醫藥學院張宏偉教授鑒定。腺嘌呤(批號：A8626，質量分數>99%)、腺嘌呤核苷(批號：A9251，質量分數>99%)、原兒茶酸(批號：03930590，質量分數>97%)、原兒茶醛(批號：D108405，質量分數>96.5%)、咖啡酸(批號：C0625，質量分數>98%)、丹參酮ⅡA(批號：T4952，質量>98%)、丹酚酸A(批號：97599，質量分數>97.5%)、丹酚酸B(批號：SML0048，質量分數>98%)、丹參素(批號：SML0679，質量分數>98%)，均購買自默克生命科學(上海)有限公司。甲醇、甲酸均為分析純(廣州光華科技股份有限公司)，水為Millipore超純水。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 采用ZORBAX Eclipse-C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)液相色譜柱；檢測柱溫為25 ℃；流動相由0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)組成，梯度洗脫(0～10 min，95%A；10～38 min，95%～0%A；38～40 min，0%A)；流速為0.5 mL/min；進樣量為2 μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI源)，在正、負兩種模式下進行掃描，分子量檢測范圍為50～1 000 D。干燥氣體積流量：14 L/min，干燥氣溫度：250 ℃，霧化氣壓力：241 kPa，裂解電壓：175 V，鞘氣流量：11 L/min，鞘氣溫度：350 ℃，鞘氣溫度：65 V，毛細管電壓：3 500 V，八級桿1射頻電壓：750 V，噴嘴電壓：1 000 V，碰撞能量：20 V。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取丹參15 g、黃連15 g、酸棗仁20 g、靈芝10 g，浸泡1 h，再加400 mL水，煮1 h后使用旋轉蒸發儀濃縮成質量濃度為1 g/mL的藥液。

2.3 對照品溶液的制備

取腺嘌呤、腺嘌呤核苷、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、丹參酮ⅡA、丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素對照品適量，精密稱定，加入甲醇配置成含各對照品質量濃度為0.5 μg/mL的混合對照品溶液。

3 結果

3.1 建立復方全成分數據庫

在國內外數據庫，包括CNKI數據庫、Pubmed、ScienceDirect、Web of Science等檢索丹參、黃連、酸棗仁、靈芝成分的有關文獻，共總結出707種復方中藥材的化學成分，其中包括275種靈芝化學成分，254種丹參化學成分，148種黃連化學成分及30種酸棗仁化學成分；建立包含化合物名稱、結構式、分子式、精確分子量的復方成分數據庫。

3.2 化合物鑒定

采用UPLC-Q-TQF-MS/MS技術，依據“2.1”項下條件檢測供試品溶液，根據保留時間的先后順序對復方中化學成分的質譜數據進行采集，得到正、負離子模式的總離子流圖(TIC)，結果見圖1。根據已建立數據庫及文獻信息，采用對照品對照、各化合物的精確質荷比、保留時間、二級碎片裂解離子并結合文獻對定心方Ⅳ號的化學成分進行進一步確證，最終在定心方Ⅳ號的供試品溶液總離子流圖中鑒別出54個化合物，包括14個酚酸類化合物、10個生物堿類化合物、8個萜類化合物、6個苯丙醇類化合物、5個黃酮類化合物和11個其他類化合物，其他類化合物包括氨基酸類、嘌呤類及木脂素類等。誤差值小于8×10-6，具體保留時間、分子式、理論值、主要碎片及藥材歸屬情況等見表1。各成分的藥材歸屬情況依據文獻及課題組前期的單味藥材液質結果進行判斷，并依據對照品與文獻對化合物進行指認及鑒定。

圖1 定心方Ⅳ號供試品的正離子模式(A)與負離子模式(B)TIC圖Figure 1 The total ion chromatogram (TIC) of positive ion mode (A) and negative ion mode (B) of DXR IV

表1 定心方Ⅳ號中的化合物鑒定Table 1 Identification of chemical constituents from DXR IV

表1 (續)

3.3 復方水提液中主要化學成分的質譜裂解規律解析

3.3.1 酚酸類化合物 共鑒定出14個酚酸類化合物，包括丹參素(峰7)、原兒茶酸(峰8)、原兒茶醛(峰12)、咖啡酸(峰14)、綠原酸(峰15)、阿魏酸(峰18)、異阿魏酸(峰24)、丹酚酸F(峰25)、丹酚酸T(峰32)、丹酚酸D(峰39)、紫草酸(峰40)、迷迭香酸(峰42)、丹酚酸B(峰43)及丹酚酸A(峰46)，其中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A經對照品對照確認。沒有對照品的化合物采用準確分子量和碎片裂解規律確定。丹酚酸類化合物是該處方中的特色化合物，主要來源于藥材丹參。在多級碎裂中，丹酚酸類化合物以丹參素基的丟失和CO及H2O的丟失較為明顯[48]。峰46的準分子離子峰為m/z493.114 0[M-H]-，二級質譜碎片離子為313.070 9[M-H-C9H8O4]-及295.061 0[M-H-C9H10O5]-，經對照品及文獻[41]對比后確認為丹酚酸A，可能裂解途徑見圖2。

3.3.2 二萜類 共鑒定出5個二萜類化合物，分別為化合物Tanshinol B(峰16)、tanshinaldehyde(峰48)、新隱丹參酮(峰52)、1,2,15,16-四氫丹參醌(峰53)及隱丹參酮(峰54)，均來自藥材丹參，且以丹參酮類化合物為特色化合物。該類成分的MS分子離子峰多為基峰，常可見丟失1個或多個CO的碎片離子峰。在tR=38.707 min時，峰54給出的準分子離子峰[M+H]+為m/z297.1485，失去一分子CO與一分子水后生成二級質譜碎片離子m/z251.143 8，與文獻[49]描述相符，故推測為隱丹參酮，可能的裂解途徑見圖3。

3.3.3 三萜類 共鑒別出3個三萜類化合物，包括Epoxyganoderiol B(峰47)、Betulonic acid(峰50)及靈芝酸Md(峰51)，該類成分主要來自靈芝及酸棗仁。峰50的準分子離子峰為m/z455.352 0[M+H]+，失去一分子CO與一分子水后生成二級質譜碎片離子m/z409.348 1，進一步裂解生成m/z369.279 0離子，結合文獻[44]鑒定為Betulonic acid。

3.3.4 生物堿類 共鑒別出10個生物堿類化合物，包括烏藥堿(峰17)、木蘭堿(峰19)、Stecepharine(峰26)、小檗紅堿(峰27)、黃連堿(峰28)、表小檗堿(峰29)、四氫小檗堿(峰31)、藥根堿(峰33)、小檗堿(峰36)、巴馬汀(峰37)，其中小檗堿(峰36)已經對照品對比確認。本處方中的生物堿類化合物來自藥材黃連及酸棗仁，且以黃連為主要來源。該類化合物在正離子模式下均產生[M+H]+的母離子，易丟失CO、CH4等。在tR=22.525 min時，峰36給出的準分子離子峰[M+H]+為m/z336.123 0，失去一分子CH3后生成m/z321.099 0離子，進一步裂解生成二級質譜碎片離子292.096 6[M+H-CH4-CO]+，結合文獻[50-51]及對照品確認為小檗堿，可能的裂解途徑見圖4。

圖2 丹酚酸A(峰46)的裂解途徑Figure 2 The fragmentation of Salvianolic acid A (Peak 46)

圖3 峰54(隱丹參酮)可能的裂解途徑Figure 3 The feasible fragmentation of Peak 54 (Cryptotanshinone)

3.3.5 黃酮類 共鑒定出5個黃酮類化合物，分別為Vicenin-II(峰23)、斯皮諾素(峰34)、當藥素(峰38)、6?-阿魏酰斯皮諾素(峰44)及煙花苷(峰45)，均來自于藥材酸棗仁。本研究依據準確分子量及碎片裂解規律對此類化合物進行鑒別確認。在質譜條件下，該類化合物主要在C環發生RDA(Retro-Diels-Alder)裂解，生成A環和B環2個碎片離子，若其A環具有5,7-二羥基取代則易失去中性分子C3O2、C2H2O等[52]。峰34在負離子模式下可見準分子離子峰m/z607.166 8[M-H]-,首先從準分子離子峰上脫去C4H8O4生成m/z487.127 4離子，進而再脫去C2H4O2生成m/z427.103 5離子；結合文獻[28]及特征碎片離子推測為斯皮諾素，裂解途徑見圖5。

圖4 小檗堿(峰36)的裂解途徑Figure 4 The fragmentation of Berberine(Peak 36)

圖5 斯皮諾素(峰34)可能的裂解途徑Figure 5 The feasible fragmentation of Spinosin (Peak 34)

3.3.6 苯丙醇類 共鑒定出6個苯丙醇類化合物，包括3-(3′4′-Dihydroxyphenyl)-(2R)-lactic acid-4′-O-β-d-glucopyranoside(峰9)、3-(3′4′-Hydroxy-phenyl)-(2R)-lactic acid(峰10)、Methyl-3-(4′-O-β-d-glucopyranosyl-3′4′-dihydroxyphenyl)-lactate(峰13)、5-O-Feruloylquinic acid(峰20)、4-O-Feruloylquinic acid(峰22)及Methyl 4-O-feruloylquicinate(峰35)。該類化合物均來自黃連，多含酚羥基及羧基，并結合文獻[14]進行指認。峰22的準分子離子峰為m/z367.103 5[M-H]-，脫去C10H10O4生成m/z173.046 6離子，結合文獻[24]推測為4-O-Feruloylquinic acid。

3.3.7 其他類 包括有機酸類、氨基酸類、嘌呤類、木脂素類等。3號峰給出準分子離子峰m/z191.019 7[M-H]-，二級質譜碎片離子為163.033 3[M-H-CO]-，結合結構式及文獻[6]推測為枸櫞酸。經對照品鑒定，分別鑒定出1號峰、5號峰為腺嘌呤與腺嘌呤核苷。

4 討論

定心方Ⅳ號中的主要成分包括以丹酚酸A/B/D/E/F及丹參素為主的酚酸類化合物，以隱丹參酮、新隱丹參酮為主的二萜類化合物，以小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿等為主的生物堿類化合物及以斯皮諾素與6?-阿魏酰斯皮諾素為主的黃酮類化合物。研究證實，丹酚酸A可減少動脈血栓形成，抑制信號轉導活化，下調極低密度脂蛋白受體，減輕血管內皮細胞損傷[53]；丹參素可通過抗氧化機制減輕血管內皮細胞損傷，發揮心血管保護作用[54]；小檗堿能抗血小板聚集，影響血栓形成，并降低實驗大鼠血清與組織中甘油三酯含量，降低血清游離脂肪酸水平，改善大鼠脂代謝[55]。此外，在定心方Ⅳ號水提液中鑒定出了酸棗仁中活性最好的抗氧化組分即6?-阿魏酰斯皮諾素，但研究顯示其與斯皮諾素在總抗氧化能力反應中呈拮抗作用[56]，提示后續研究需進一步測定復方中各化學成分的含量，以便區分復方中實際發揮抗氧化作用的有效成分。本研究表明，定心方Ⅳ號水提液中包含多種可抗氧化、保護血管內皮細胞、減小血栓形成及改善脂代謝的化學成分，有利于抗動脈粥樣硬化，該結果與動物實驗結果相符。由此可見，定心方Ⅳ號清熱解毒、益氣活血的作用確有一定的現代藥理基礎。

值得注意的是，雖然各單味藥材化學成分所組成的復方數據庫中成分數量繁多，但實際指認出的成分僅有54種，可能由溶劑、藥材品質、藥材批次等原因所致。由于組成復方的藥材成分較為復雜、所含同分異構體較多、部分成分可參考文獻較少、無統一化合物名稱等因素，使部分成分指認的可信程度受損。此外，各藥材成分重疊度雖較小，能根據保留時間進行一定程度的區分，但仍然對探究定心方Ⅳ號的化學成分有所阻礙。在更進一步的研究中，應增加供試藥材的批量，建立定量結構分析的結構鑒定方法，并對各成分進行定量分析。

綜上，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，首次對定心方Ⅳ號水提液所含的化學成分進行了分析，較傳統方法有更高的分離度及敏銳度，基本闡明了復方的組成成分，對定心方Ⅳ號水提液成分的研究與鑒定有一定價值，為進一步闡明定心方Ⅳ號的藥效物質基礎及藥理作用研究提供參考。