HPLC-UV法測定魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯

蔡文堅，謝春燕，柳文俊，鐘棱，曾少群，岳峰

(廣東嘉博制藥有限公司，廣東 清遠 511517)

魚油脂肪乳注射液因其豐富的ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFAs)而具有獨特的藥理作用，尤其在抗感染、降血脂、抗抑郁、免疫調節以及輔助改善記憶等方面有突出的效果[1-5]。魚油含有豐富的ω-3PUFAs，極易發生氧化反應，從而導致魚油變質。開發魚油脂肪乳需要使用一種安全、有效的抗氧化劑，以避免氧化酸敗。

L-抗壞血酸棕櫚酸酯是一種高效的氧清除劑和增效劑[6]，被《美國藥典》收載作為醫藥輔料，具有安全性高和營養價值高等特點[7-8]，在油脂抗氧化領域有廣泛的應用[9-11]。在開發魚油脂肪乳制劑時，采用L-抗壞血酸棕櫚酸酯作為抗氧化劑，可以獲得良好的效果。同時根據國家食品藥品審批中心指導原則的要求，藥品中的抗氧化劑必需進行檢測，并在長期存儲過程中檢測控制。

目前，文獻主要報道的是測定食品、奶粉以及油脂中抗壞血酸棕櫚酸酯的檢測方法，國內未見測定魚油脂肪乳注射液中的L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的文獻報道。本研究擬建立一種測定魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的HPLC-UV法，為開發脂肪乳劑中L-抗壞血酸棕櫚酸酯的檢測提供參考數據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀；BT125D十萬分之一電子分析天平(Sartorius)。

1.2 試藥

L-抗壞血酸棕櫚酸酯對照品(批號：BCBL 0771V，質量分數：98.9%，Sigma公司)；抗壞血酸對照品(批號：20101101-1，分析純，廣州化學試劑廠)；魚油脂肪乳注射液(批號：18150401、18150402、18150403，廣東嘉博制藥有限公司)；甲醇(HPLC級，Sinence公司)；四氫呋喃(HPLC級，Merk公司)；水為純化水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(100 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相：以KH2PO4溶液-甲醇(體積比25∶75)為流動相A，以四氫呋喃-水(體積比45∶55)為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序(0～30 min，95%A；31～41 min，5%A；42～46 min，100%A)；流速：0.7 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：40 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 流動相A 取KH2PO41.0 g，置1 000 mL量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，取KH2PO4緩沖液250 mL及甲醇750 mL置1 000 mL燒杯中，用磷酸調pH至4.0，濾過并進行超聲波脫氣。

2.2.2 流動相B 取四氫呋喃450 mL及純化水550 mL置1 000 mL燒杯中，超聲波脫氣，即得。

2.2.3 稀釋液 精密稱取抗壞血酸50 mg，置1 000 mL量瓶中，用甲醇-水(體積比8∶2)溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.4 對照品溶液 精密稱取L-抗壞血酸棕櫚酸酯25 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1 mL，置25 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，制成每1 mL中含0.02 mg的對照品溶液。

2.2.5 缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯陰性溶液 稱取魚油30 g放置燒杯中，加入蛋黃卵磷脂3.6 g攪拌均勻，得油相，備用。將甘油7.5 g溶于270 mL的水中，得水相。然后將上述油相倒入水相攪拌成乳劑，即得缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯陰性溶液。

2.2.6 供試品溶液 取供試品原液在N2保護下放置于取樣瓶中。

2.3 專屬性試驗

分別取稀釋液(空白溶劑)、缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯陰性溶液、對照品溶液和供試品溶液，照“2.1”項色譜條件進樣分析，結果顯示空白溶劑和其他原輔料不干擾L-抗壞血酸棕櫚酸酯的測定，色譜圖見圖1。

ABCD180160140120100806040200180160140120100806040200180160140120100806040200180160140120100806040200mAUmAUmAUmAUt/min28.00527.536048121620343832364044

2.4 檢測限及定量限

取L-抗壞血酸棕櫚酸酯對照品溶液逐級稀釋至信噪比約為10∶1的濃度為定量限，信噪比約為3∶1的濃度為檢測限。L-抗壞血酸棕櫚酸酯定量限為8 μg/mL，檢測限為2 μg/mL。同時，進樣6針定量限濃度樣品，峰面積的RSD值為1.7%。

2.5 標準曲線的制備

稱取L-抗壞血酸棕櫚酸酯對照品適量，精密稱定，溶于抗壞血酸溶液中，超聲溶解并稀釋至刻度，得到質量濃度為1.022 mg/mL的對照品溶液。精密量取上述溶液0.5、1、2、4、5 mL至10 mL量瓶中，加入抗壞血酸溶液定容至刻度，搖勻，得到系列濃度溶液。分別注入液相色譜儀，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，得到線性方程Y=5 171.4X+11.097，r=0.999 7，表明L-抗壞血酸棕櫚酸酯質量濃度在0.050 1～0.501 1 mg/mL范圍內與峰面積成良好線性關系。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，連續進樣6針，結果測得主峰峰面積RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取本品6份，每份溶液連續進樣2次，測得每份供試品溶液的平均質量濃度為0.20 mg/mL，其RSD值為1.0%，表明方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，在N2保護下密封于取樣瓶，放置2、4、6、8 h后取樣注入液相色譜儀，測得峰面積RSD值為1.2%，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.9 回收率試驗

精密稱取L-抗壞血酸棕櫚酸酯16、20、24 mg至100 mL量瓶中，在N2保護下加入空白溶液(缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯處方)充分搖勻溶解并定容，得到相當于供試品溶液80%、100%和120%的3個濃度溶液。取對照品和供試品溶液進樣分析，結果測得9份溶液的回收率在99.2%～102.0%之間，平均回收率為99.5%，RSD為1.3%，表明方法準確度良好，見表1。

2.10 耐用性考察

取供試品溶液和對照品溶液進樣，柱溫變化±5 ℃、流速變化20%、波長變化±5 nm時，結果測得供試品中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的RSD值為0%，表明方法耐用性良好。

2.11 樣品測定

取批號為18150401、18150402、18150403的3批魚油脂肪乳注射液進行檢測，結果測得L-抗壞血酸棕櫚酸酯平均質量濃度分別為0.211 3、0.210 4、0.217 3 mg/mL(n=3)。

表1 L-抗壞血酸棕櫚酸酯的加樣回收率試驗Table 1 Results of recovery test of L-ascorbgyl palmitate

3 討論

目前，文獻報道的L-抗壞血酸棕櫚酸酯檢測方法主要有碘量法[12]、硅鉬蘭分光光度法[13]、2，6-二氯酚靛酚法[14]、薄層色譜法[15]。碘量法操作簡單，但魚油脂肪乳注射液為乳白色混懸液體，影響滴定終點的判斷；硅鉬蘭分光光度法需要的試劑多，操作繁瑣，影響結果的重復性；2，6-二氯酚靛酚法簡便易行、快速，以目測判斷終點，誤差較大；薄層色譜法要經過制板、點樣、展開、顯色等處理，操作較繁瑣。有報道選擇HPLC-ELSD 法檢測抗壞血酸棕櫚酸酯[16]。蒸發光散射檢測器(ELSD)是一種通用型的檢測器，可檢測揮發性低于流動相的任何樣品。但考慮脂肪乳劑含有的有機物質組分較多，有可能會受到其他組分(如油脂)的干擾。

L-抗壞血酸棕櫚酸酯作為脂肪乳劑的抗氧化劑，具有易被氧化的特點。如分析前對乳劑進行分離處理該抗氧化劑容易被氧化，考慮到魚油脂肪乳中油脂含量較低(約占10%)，制備成納米乳粒，流動性好，進樣后可直接溶于流動相中。直接進樣可以滿足檢測要求，同時也避免處理樣品時造成L-抗壞血酸棕櫚酸酯氧化。但如直接進樣，脂肪乳劑含有一定量的油脂，長期反復進樣有使反相柱柱效下降的風險。因此，本方法在主峰出來之后繼續使用較高濃度的四氫呋喃對殘留在色譜柱中的油脂進行洗脫，可減緩色譜柱柱效下降。同時，L-抗壞血酸棕櫚酸酯含有酯結構容易水解，需要注意pH值。

本文建立了測定魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的HPLC-UV法，該方法操作快捷簡便，精密度、重復性、穩定性良好，結果準確可靠，可作為魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的檢查方法。