基于多元統計分析的金銀花、山銀花及川銀花質量評價研究

邱連建，索彩仙，潘禮業，李國衛，胡綺萍，孫冬梅

(1.北京中醫藥大學深圳醫院(龍崗)，廣東 深圳 518000； 2.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

忍冬始載于《名醫別錄》，《新修本草》和《證類本草》等古籍均有收錄[1]。目前，市面上流通較廣的忍冬藥材主要有金銀花、山銀花、川銀花，其中金銀花、山銀花為2020年版《中國藥典》收載品種，川銀花為2010年版《四川省中藥材標準》收載品種[2-3]?！吨袊参镏尽分杏涊d了忍冬科植物在我國有98種之多，廣泛分布于全國各省區，其中金銀花以山東平邑、河南封丘為主要產區，山銀花主產于湖北、云南、貴州、廣西等東南地區和西南地區，川銀花則主產于四川，3者均具有清熱解毒、疏散風熱、抑菌抗菌、抗病毒的功能，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒以及溫病發熱等病癥[4-5]。

在2005年版之前的《中國藥典》中，金銀花和山銀花作為同一種藥材收載，2005年版《中國藥典》正式將金銀花和山銀花進行區分，有關兩者的研究較多[6-12]。金銀花、山銀花、川銀花在成分、功效主治方面十分接近。鑒于金銀花為藥食同源，現階段雖人工種植已成規模，仍供不應求，所以藥材市場仍存在摻偽混淆等現象，因此，金銀花與同科屬其他相關藥材的鑒別仍十分必要。

本文對金銀花、山銀花、川銀花3種不同忍冬科藥材進行了研究，在建立多指標含量測定的基礎上，結合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析，比較不同忍冬科藥材的差異性，為忍冬科藥材鑒別和質量評價提供了參考。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters BEH Phenyl 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 mm)；Mettler XP-26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q型超純水凈化系統(美國Millipore公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(Merk)；水為Mili-Q純化水；其余試劑為分析純。

綠原酸(批號：110753-201817，質量分數：96.8%)、馬錢苷(批號：111640-201808，質量分數：99.0%)、蘆丁(批號：10080-201811，質量分數：91.7%)、木犀草苷(批號：111720-201609，質量分數：94.9%)對照品，由中國食品藥品檢定研究院提供；異綠原酸A(批號：wkq18041207，質量分數：98%)、異綠原酸B(批號：wkq17060705，質量分數：98%)、異綠原酸C(批號：wkq18050905，質量分數：98%)、隱綠原酸(批號：wkq16081903，質量分數：98%)、新綠原酸(批號：wkq16050805，質量分數：98%)、獐牙菜苷(批號：wqk17092203，質量分數：98%)對照品，由四川省維克奇生物科技有限公司提供；實驗所用藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，J01～J12為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花；S01～S12為忍冬科植物黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花；C01～C12為忍冬科植物淡紅忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或帶初開的花。藥材詳情信息見表1。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為12.201、456.609、7.901、7.790、14.906、17.916、11.851、8.129、270.480、30.679 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%(體積分數，下同)甲醇50 mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

采用Waters BEH Phenyl(100 mm×2.1 mm，1.7 mm)色譜柱；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm；進樣量為1 μL，以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～1 min，4%→5%A；1～9 min，5%→6%A；9～13 min，6%→10%A；13～15 min，10%→14%A；15～30 min，14%→25%A)。色譜圖見圖1。

表1 藥材詳情信息表Table 1 Information of medicinal material

ABCD051015202530t/min7891065432178910654321891032189104321

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 取“2.1”項混合對照品溶液，加甲醇稀釋制得6個不同質量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標、質量濃度(μg/mL)為橫坐標進行線性回歸，結果見表2。可見，各個對照品的線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 取同一供試品溶液(J03)，按“2.3”項色譜條件，連續進樣6次，結果測得10種成分峰面積的RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液(J03)，按“2.3”項的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，結果測得10種成分峰面積的RSD值均小于2%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取樣品粉末(J03)約0.5 g，平行6份，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件測定，結果測得10種成分峰面積的RSD小于2%，表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取樣品粉末(J03)0.25 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件進行測定，結果測得10種成分的平均加樣回收率均在94.15%～106.79%范圍內，RSD值均小于3%，見表3。

2.5 結果與分析

2.5.1 質量分數測定結果 精密稱取36批樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件進樣測定，結果見表4?？梢姡?種藥材的10種成分質量分數存在顯著差異，RSD值在48.18%～153.83%之間。其中，RSD值大于80%的包括5個成分，分別為隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷，經過分析多批次樣品，發現獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷為金銀花的特有成分；馬錢苷在金銀花和川銀花兩類樣品能檢出；新綠原酸為3種樣品的共有成分，但在川銀花中質量分數最高，均值為2.264 mg/g，金銀花與山銀花中的分別為0.707、0.613 mg/g。綠原酸為2015年版《中國藥典》中金銀花的規定指標成分，本文結果顯示：綠原酸在金銀花中的質量分數較高且較穩定，均值為27.215 mg/g，組內RSD為4.50%；在山銀花中較低，且不穩定，均值為9.600 mg/g，組內RSD為54.09%；在川銀花中最高且穩定，均值為48.556 mg/g，組內RSD為1.28%。

表2 10種成分的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equation and linear range of 10 ingredients

表3 10種成分的加樣回收率試驗結果Table 3 Recovery results of 10 ingredients(n=6)

表4 36批樣品含量測定結果

表4 (續)

2.5.2 聚類分析 運用SPSS軟件對36批藥材樣品10種成分的質量分數測定結果進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚類分析圖見圖2?？梢姡?6批樣品聚為3類，J01～J12為金銀花聚為一類，S01～S12為山銀花聚為一類，C01～C12為川銀花聚為一類。

2.5.3 主成分分析(PCA) 以10種成分質量分數測定結果為變量，采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，由表5可見，共提取了2個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻率達93.996%，表明可以用2個主成分反映不同基原忍冬科藥材主要的質量特征。從表6可見，在第1主成分有較高載荷的包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷，主要為酚酸類成分；在第2主成分有較高載荷的包括獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷，主要為黃酮類成分。從表7降維得到的2個主成分得分(載荷值>0.90)結果顯示，金銀花樣品主成分2評分均為正值，川銀花樣品主成分1評分均為正值，山銀花樣品則2個主成分評分均為負值，因此，從主成分的評分可以對不同樣品實現區分。

0510152025333631293230262734283525222313242021181917141615675891112410312YC09C12C07C05C08C06C02C03C10C04C11C01S10S11S01S12S08S09S06S07S05S02S04S03J06J07J05J08J09J11J12J04J10J03J01J02

表5 特征根、各主成分的貢獻率Table 5 Contribution rate of characteristic roots and principal components

表6 各因子初始因子載荷矩陣Table 6 Initial factor load matrix of each factor

表7 主成分得分Table 7 Principal component score

2.5.4 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 依據PCA結果，對3種不同藥材樣品進行OPLS-DA分析。該OPLS-DA模型，R2X(cum)=0.940，R2X(cum)=0.987，Q2(cum)=0.985，均大于0.5，說明模型穩定可靠，可用于忍冬科不同藥材樣品的區分。從圖3可見，數據的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使3種樣本點完全被分開，相互之間沒有樣品出現交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區間之內。采用變量重要性投影值( variable importance in project，VIP) 篩選造成3種基原忍冬科樣品差異性的標志物，其中VIP值大于1的成分包括5個，分別為蘆丁、木犀草苷、獐牙菜苷、綠原酸、馬錢苷，是導致3種不同忍冬科藥材樣品間差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區分影響較小，結果見圖4。

圖3 36批樣品的OPLS-DA得分圖Figure 3 OPLS-DA score of 36 batches of samples

圖4 10個化學成分的VIP值Figure 4 VIP values of 10 ingredients

3 討論

金銀花成分主要以酚酸類為主，故關于金銀花研究多以350 nm為檢測波長，但本研究是對3種不同忍冬科藥材的系統分析，考慮到兼顧其他成分，通過全波長掃描，發現240 nm檢測波長所得到的色譜峰較350 nm的色譜峰信息多，且峰型較好，故選用240 nm作為檢測波長。

王瑩[13]、黃玉娟等[14]均對金銀花與山銀花的質量差異進行了探討，結果顯示綠原酸、蘆丁、木犀草苷等成分在2種藥材中的含量存在差異，但尚未有川銀花與金銀花、川銀花差異比較的文獻報道。本研究對3種忍冬科藥材的10種成分進行了定量分析，結果顯示金銀花、山銀花、川銀花組內具有共性規律，但組間存在明顯差異。其中，直觀結果分析顯示，金銀花含有3個特有成分(獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷)，山銀花則不含有馬錢苷，而新綠原酸為最直觀反映3種藥材差異的共有成分，其含量大小為川銀花>金銀花>山銀花，綠原酸亦呈現同樣規律。聚類分析、主成分分析、OPLS-DA分析結果一致，均能將3種忍冬科藥材進行區分，提示蘆丁、木犀草苷、獐牙菜苷、綠原酸、馬錢苷等成分可能為區分3種忍冬科藥材的質量標準物。川銀花作為四川地區的習用品，其功效主治與金銀花、山銀花具有一定的相似性。本研究通過對比研究發現其成分與后兩者具有一定的相似性，為闡明其藥效物質基礎提供參考，同時本研究在山銀花中未檢出馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷，在川銀花中未檢出獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷，建立的方法可對3種藥材進行鑒別，也為3種藥材的質量控制提供了參考方法。

本研究建立了忍冬科藥材10個指標成分的UPLC含量測定方法，對36個不同藥材樣本進行了測定，并采用聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析對含量測定結果進行了分析，分析結果顯示3種不同忍冬科藥材存在一定差異，為忍冬科藥材的質量控制提供了可靠的分析方法與參考依據。