不同產地茜草藥材UPLC指紋圖譜研究及化學計量學分析

王閩予，何民友，李國衛，鄧淙友，孫冬梅

(1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

茜草始載于《神農本草經》，原名“茜根”，為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖，味苦，性寒，歸肝經，具有涼血、祛瘀、止血、通經的功效，用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經閉、關節痹痛、跌撲腫痛[1]。茜草中主要含有蒽醌及其苷類、萘醌及其苷類、環己肽類、多糖類、萜類等成分[2-4]，具有抗腫瘤、升高白細胞及免疫調節、護肝、抗風濕、抗氧化、止血、抑菌等作用[5-7]。茜草主產于安徽、江蘇、山東、河南、陜西等地，以陜西、河南出產者量大且質優[8-10]。

2015年版《中國藥典》中以大葉茜草素、羥基茜草素作為評價茜草藥材質量的指標。中藥材來源廣泛，成分復雜，以單個或幾個目標成分的檢測和控制難以反應藥材的質量[11]。中藥指紋圖譜技術可以整體、宏觀地表征被測樣品主要化學成分的特征，是目前公認的最適合中藥物質群質量控制的手段之一，用于中藥質量的整體評價[12-15]。本研究建立茜草藥材的UPLC指紋圖譜，并結合聚類分析和相似度評價對不同產地的茜草藥材進行評價，為全面評價茜草藥材質量提供參考。

1 儀器與材料

Waters H-Class型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；ME204E型萬分之一天平(10 mg～220 g，d=0.1 mg)、XP26型百萬分之一天平(量程22 g，d=0.001 mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHz)；Milli-Q Direct型超純水系統(美國默克股份有限公司)。

羥基茜草素對照品(批號：111898-201603；質量分數：98.5%)、大葉茜草素對照品(批號：110884-201606；質量分數：99.5%)、茜草對照藥材(批號：121049-201705)均由中國食品藥品檢定研究院提供；三乙胺、三氟乙酸、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

茜草樣品經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖，18批茜草藥材信息詳見表1，均符合2015年版《中國藥典》規定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS UPLC T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；進樣量為2 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為260 nm；以甲醇為流動相A，以含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸的溶液為流動相B，按表2進行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min。

表1 18批茜草藥材信息表Table 1 Information of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表2 梯度洗脫程序表Table 2 Gradient elution

2.2 對照品溶液的制備

取羥基茜草素、大葉茜草素對照品適量，加甲醇制成羥基茜草素質量濃度為36.33 μg/mL、大葉茜草素質量濃度為31.98 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 對照藥材溶液的制備

取茜草對照藥材0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%HCl溶液(體積比4∶1，下同)100 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用甲醇-25%HCl溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得對照藥材溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取茜草粉末(過二號篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25% HCl溶液(4∶1)100 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，用甲醇-25% HCl溶液(4∶1)補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項色譜條件重復進樣6次。以羥基茜草素峰為參照峰(S峰)，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值分別為0.05%～0.33%、0.56%～1.49%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，以羥基茜草素峰為參照峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值分別為0.05%～0.45%、0.41%～1.41%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.3 重復性試驗 取同一批茜草藥材(批號S4)粉末平行6份，按“2.4”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定。以羥基茜草素峰為參照峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值分別為0.09%～0.33%、0.98%～2.67%，表明方法重復性良好。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 茜草藥材指紋圖譜的建立 取18批茜草藥材，按“2.4”項方法制備供試品溶液，取上述18批供試品溶液及茜草對照藥材溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定。茜草藥材對照指紋圖譜見圖1，茜草對照藥材指紋圖譜見圖2，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》對18批茜草藥材指紋圖譜進行共有峰標識，結果見圖3。

121620242832364044048t/minR(9)200150100500240U/mV7896(S)54321

121620242832364044048t/min20016012080400U/mV123456(S)789

10009008007006005004003002001000U/mVS18S17S16S15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1121620242832364044048t/min1234576(S)98

2.6.2 共有峰的確定 對18批茜草藥材指紋圖譜進行分析，共有9個特征峰，經與對照藥材參照物色譜進行比對，指認了其中的5個特征峰，分別是3號峰山柰素、5號峰茜草素、6號峰羥基茜草素、7號峰1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、8號峰大葉茜草素，羥基茜草素的峰面積較大、分離度較好，故以其為參照峰(S峰)，計算各特征峰與S峰的相對保留時間與相對峰面積，并計算RSD值，結果見表3、表4。可見，以羥基茜草素峰為參照峰，18批茜草藥材指紋圖譜的其余8個特征峰相對保留時間RSD值在0.25%～1.50%，均小于3.0%；18批茜草藥材指紋圖譜的9個特征峰相對峰面積的RSD在19.07%～70.84%，結果表明不同產地茜草藥材的各特征峰峰面積存在一定差異。

2.6.3 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012年版)，以茜草對照藥材指紋圖譜為參照，進行整體相似度評價，除S4相似度較低為0.637之外，其余17批不同產地茜草藥材的相似度為0.871～0.983，見表5。

表3 18批茜草藥材指紋圖譜相對保留時間測定結果Table 3 Relative retention time of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表4 18批茜草藥材指紋圖譜相對峰面積測定結果Table 4 Relative peak area of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表5 18批茜草藥材 UPLC指紋圖譜相似度結果

2.7 聚類分析 將18批茜草藥材指紋圖譜的9個共有峰的相對峰面積導入SPSS20.0軟件，采用Eu-clidean距離進行聚類分析，結果見圖4，當類間距離為25時，18批茜草藥材可分為2類，S6～S7、S9～S11、S17～S18為一類，包含6批河南省和1批山東省樣品，S1～S5、S8、S12～S16為一類，包含5批河北省、2批河南省及陜西省、山西省、山東省各1批樣品。

910761117185151213141681234S9S10S7S6S11S17S18S5S15S12S13S14S16S8S1S2S3S4Y0510152025

2.8 大葉茜草素、羥基茜草素質量分數的測定

2.8.1 線性關系考察 取羥基茜草素和大葉茜草素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含羥基茜草素204.0 μg、大葉茜草素170.1 μg的混合對照品儲備液。精密量取上述混合儲備液0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得對照品線性溶液。精密吸取對照品線性溶液和混合對照品儲備液各2 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣測量，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(y)、對照品質量濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線，得到線性回歸方程：羥基茜草素，y=48 068.341 3x-25 699.997 6，r=0.999 7，線性范圍2.040～204.0 μg/mL；大葉茜草素，y=28 091.977 5x-7 320.780 9，r=0.999 6，線性范圍1.702～170.1 μg/mL。

2.8.2 精密度試驗 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，計算羥基茜草素、大葉茜草素峰面積的RSD值分別為0.07%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩定性試驗 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，計算羥基茜草素、大葉茜草素峰面積的RSD值分別為0.38%、0.99%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8.4 重復性試驗 取同一批茜草藥材(批號S4)約0.5 g，精密稱定，平行稱定6份，按“2.4”項下確定的供試品溶液制備方法，制備供試品溶液6份。按“2.1”項下色譜條件測定，計算羥基茜草素、大葉茜草素峰面積的RSD值分別為1.68%、1.24%，表明方法重復性良好。

2.8.5 加樣回收率試驗 取同一批茜草藥材(批號S4，大葉茜草素的質量分數為4.40 mg/g，羥基茜草素的質量分數為3.62 mg/g)，約0.25 g，精密稱定，分為3組，每組平行稱定3份，分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入對照品，按“2.4”項方法制備供試品溶液9份，按“2.1”項色譜條件進行測定，計算羥基茜草素、大葉茜草素的平均加樣回收率分別為103.5%、98.8%，RSD值分別為2.67%、2.60%，表明方法準確度良好。

2.8.6 樣品測定 取18批茜草藥材，按“2.4”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，18批茜草藥材中大葉茜草素、羥基茜草素的質量分數測定結果見表6。可見，18批茜草藥材的大葉茜草素質量分數范圍為0.47%～1.18%，羥基茜草素的為0.36%～0.9%，其中S6、S7、S9、S10、S11的大葉茜草素質量分數較高，分別為1.18%、1.06%、0.94%、0.81%和0.81%，S17、S18的羥基茜草素質量分數較高，分別為0.90%和0.81%，表明河南省產的茜草藥材質量較優。

表6 18批茜草藥材中2種成分的質量分數測定結果

3 討論

本研究對檢測波長、色譜條件、供試品制備等進行了考察，經紫外-可見全波長(190～400 nm)掃描，發現在260 nm處各色譜峰較響應值較均勻，各色譜峰信號較強，基線平穩，干擾較小，因此選擇260 nm作為檢測波長；同時對甲醇-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液、乙腈-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.3%甲酸、甲醇-0.2%三乙胺和甲醇-0.2%三氟乙酸等不同組成的流動相進行了考察，結果以甲醇-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液梯度洗脫樣品分離較佳。對CORTECS T3(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)、YMC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Waters HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)4種品牌色譜柱的色譜圖進行比較，發現不同品牌色譜柱對各特征峰分離影響較大，使用CORTECS T3(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)色譜柱各特征峰分離效果較好。在供試品溶液前處理中對比三乙胺用量、不同提取溶劑、提取方式及提取時間，發現使用甲醇-25%鹽酸(4∶1)混合溶液100 mL加熱回流60 min為最佳。

運用相似度評價、聚類分析2種方法對不同產地茜草藥材UPLC指紋圖譜進行分析。以茜草對照藥材指紋圖譜為對照，除S4相似度較低為0.637之外，其余17批不同產地茜草藥材的相似度為0.871～0.983，全部在0.8以上，說明不同產地藥材表現出了良好的相似度。聚類分析結果，除了2批河南省和1批山東省的藥材之外，可以將剩余河南省藥材與其他省份藥材區分開來，說明河南省所產茜草藥材質量比較相近，其他省份茜草藥材質量與之不同。含量測定結果顯示，河南省所產茜草藥材中大葉茜草素和羥基茜草素的質量分數較高，質量較優，與聚類分析的結果相吻合。

本研究建立了茜草藥材的UPLC指紋圖譜方法，共生成9個共有峰，較普通液相分析時間縮短了40 min，結合化學計量學分析，可較好的區分河南省與其他省份所產茜草藥材，為茜草藥材的綜合評價提供了參考。