基于UPLC指紋圖譜的不同產地墨旱蓮藥材質量評價

曹斯瓊，程學仁，孫冬梅，索彩仙，周湘媛，邱韻靜，李國衛

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

墨旱蓮別稱旱蓮草、金陵草、白花蟛蜞菊等，以原名鱧腸始載于《唐本草》[1]，為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，野生為主，生于河邊、田邊或路旁，主產河南、安徽、廣東、廣西、江蘇、山東等省區[2]。墨旱蓮是常用中藥之一，具有滋補肝腎、涼血止血的功效，用于肝腎陰虛、牙齒松動、須發早白[3]。近代藥理學研究表明，墨旱蓮有免疫調節、抗氧化、抗感染、抗骨質疏松、抗菌、調血脂[4-8]等活性作用。

墨旱蓮含有三萜皂苷類、噻吩類、香豆素、黃酮類、生物堿等成分[9-12]。目前，2015年版《中國藥典》墨旱蓮藥材項下僅對蟛蜞菊內酯單一化學成分進行含量測定，然而傳統中藥的療效是多成分共同作用的結果，單一活性成分并不能準確反映藥材整體的質量。本文采用超高效液相色譜法(UPLC)建立墨旱蓮藥材的指紋圖譜，結合指紋圖譜的相似度計算及化學計量學分析方法，評價不同產地的墨旱蓮藥材質量，為墨旱蓮藥材質量標準的提高提供科學依據。

1 儀器與材料

Waters H-Class超高效液相色譜儀(沃特斯公司)；Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)色譜柱；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

咖啡酸對照品(質量分數：99.7%，批號：110885-201703)、木犀草苷對照品(質量分數：94.9%，批號：111720-201609)、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸對照品(質量分數：94.1%，批號：111894-201102)、蟛蜞菊內酯對照品(質量分數：99.6%，批號：111885-201403)均由中國食品藥品檢定研究院提供；3,4-二咖啡酰奎寧酸(質量分數：98.0%，批號：wkq17060705)由四川維克奇生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇為分析純；乙腈、三乙胺、磷酸為色譜純，水為超純水。

18批墨旱蓮藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，來源見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動相A，磷酸緩沖液(含0.53%磷酸和0.8%三乙胺)為流動相B，梯度洗脫(0～3 min，11%～16%A；3～9 min，16%A；9～20 min，16%～20%A；20～34 min，20%A；34～40 min，20%～80%A)；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；進樣量：1 μL。

表1 墨旱蓮藥材來源Table 1 sample source information of Eclipta Herba

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蟛蜞菊內酯、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、木犀草苷和3,4-二咖啡酰奎寧酸對照品適量，加甲醇制得質量濃度分別為7.705、4.033、8.467、7.550、9.267 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取墨旱蓮藥材粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分數70%乙醇50 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用體積分數70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 UPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液(M1)，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，以蟛蜞菊內酯峰為參比峰，計算得各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液(M1)，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，以蟛蜞菊內酯為參比峰，計算得各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取樣品粉末(M1，過三號篩)6份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以蟛蜞菊內酯峰為參比峰，計算得各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3%，表明方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與相似度評價

取18批墨旱蓮藥材樣品，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定，記錄色譜圖。將18批藥材指紋圖譜cdf格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，將M1號樣品的指紋圖譜作為參照圖譜，并進行全峰匹配，18批墨旱蓮藥材指紋圖譜疊加圖標定共有峰8個，以平均數法生成墨旱蓮藥材對照圖譜，結果見圖1、圖2。各批樣品的共有峰的“峰面積/稱樣量”見表3，各共有峰較穩定，具有指紋圖譜特征性，可初步定為墨旱蓮藥材的指標成分群。經與對照品對照，確認1號峰為咖啡酸峰，2號峰為木犀草苷峰，5號峰為4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸峰，8號峰為蟛蜞菊內酯峰。因蟛蜞菊內酯峰分離效果好、出峰穩定，選定為參照峰。對18批墨旱蓮藥材進行相似度評價，18批樣品除M8外，均在0.90以上，說明各批次間相似度良好，結果見表3。

360340320300280260240220200180160140120100806040200M18M17M16M15M14M13M12M11M10M9M8M7M6M5M4M3M2M10246810121416182022242628303234363840t/minU/mV

2.6 墨旱蓮指紋圖譜的化學計量學分析

2.6.1 聚類分析 采用SPSS20.0軟件，以墨旱蓮藥材的8個共有峰的“峰面積/稱樣量”為變量，采用組間聯接方法對18批墨旱蓮藥材進行聚類分析，結果見圖3。可見，當判別條件距離為5時，18批墨旱蓮藥材被大致分為3類，M8藥材成一類，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一類，其余的為一類，這與指紋圖譜相似度評價的結果一致。

U/mV5040302010020181614121086420U/mV01020304010152025303505t/minAB

2.6.2 主成分分析 以藥材的8個共有峰峰面積為變量進行主成分分析，以主成分特征值大于1為提取原則，根據表4的結果提取了2個主成分，累積貢獻率達到84.952%，基本能代表原樣本的信息。成分載荷矩陣的數值及符號代表變量在主成分當中的載荷，載荷越大，表明該化合物在藥材主成分分析中作用越大。由表5可見，峰1、峰3、峰5對成分1的影響大，對應的成分為咖啡酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸；峰6、峰7、峰8對成分2的影響大，峰8為蟛蜞菊內酯，為2015年版《中國藥典》含量測定指標。以上結果說明，影響墨旱蓮藥材質量的主要因素為酚酸類成分。酚酸類成分具有抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、調節血脂及保肝等多種生物活性[13-14]，這與墨旱蓮的現代藥理作用相關。

以表6中的主成分1、主成分2的得分分別為橫、縱坐標，生成18個樣品主成分得分圖，可以看出：M8藥材成一類，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一類，其余的為一類，與聚類分析及特征圖譜相似度分析的結果均一致，結果見圖4。

表2 18批墨旱蓮藥材指紋圖譜共有峰峰面積測定結果Table 2 Results of common peak areas of specific chromatogram of 18 batches Eclipta Herba

表3 18批墨旱蓮藥材墨旱蓮藥材指紋圖譜相似度評價

0510152025471812141511756161011291338M4M7M18M12M14M15M1M17M5M6M16M10M11M2M9M13M3M8Y

表4 特征值及方差分析Table 4 characteristic value and analysis of variance

表5 主成分載荷矩陣Table 5 Principal component load matrix

表6 主成分得分表Table 6 Component score table

2.0001.0000.000-1.000-2.000主成分24.0002.0000.000-2.000主成分1

3 討論

墨旱蓮中含有香豆草醚類、皂苷類成分，故選用0.53%磷酸和0.8%三乙胺緩沖液為流動相，色譜峰峰形最優，基線平穩。供試品溶液的制備分別考察了甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇的提取效果，結果70%乙醇的提取效果最優，能最大限度地提取墨旱蓮藥材的有效成分；通過對比回流和超聲2種提取方式，發現提取方式對墨旱蓮藥材的提取率影響較大，回流提取明顯優于超聲提取，故選擇回流提取；同時還考察了不同提取時間(30、60、90 min)，結果表明加熱回流60 min的提取效果較好。

本研究對18批墨旱蓮藥材進行了相似度評價，結果顯示18批樣品除M8外，相似度均在0.90以上，說明各批次間相似度良好；并對共有峰峰面積進行聚類分析，結果顯示18批墨旱蓮藥材被大致分為3類，M8藥材成一類，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一類，其余的為一類，這與相似度評價的結果一致。利用主成分分析法，將8個共有峰變量降維為2個主成分變量，2個主成分能代表8個共有峰84.95%的信息，可將18批藥材分為3類，與相似度和聚類分析的結果一致。

結合表6 綜合得分分析結果，3種分析方法是基于藥材質量把不同產地的墨旱蓮藥材分為3類：第1類為綜合評分排名10～18的9批樣品，分別為江蘇3批，山東、安徽各2批，廣西、廣東各1批，該類樣品質量較差，含量偏低；第2類為綜合評分排名2～9的8批樣品，分別為江蘇3批，廣東2批，安徽、河南、山東各1批，該類樣品質量較優，含量較高，為《中國藥典》規定值的2～5倍；第3類為綜合評分排名第1的河南1批樣品(M8)，該樣品特征峰響應較其他批次樣品高，其中影響主成分1的3個主要色譜峰為峰1、峰3、峰5，峰面積為其他批次的2.5倍以上，含量亦達到《中國藥典》規定值的3.8倍，質量最好。綜上，本研究中河南產地的墨旱蓮藥材排名均在前十，質量最優；廣東產地的大部分藥材排名靠前，質量次之；廣西產地的藥材排名靠后，質量較差；江蘇、山東、安徽的藥材質量呈現兩頭分布，說明這3個產地的藥材質量不穩定。

本研究所建立的墨旱蓮藥材UPLC指紋圖譜分析方法方便快捷、專屬性強，可為墨旱蓮藥材質量評價提供科學的方法，并為優選墨旱蓮藥材產地提供了實驗依據。