山楂飲片及炮制品的HPLC指紋圖譜研究

王紫馨，萬軍，李怡然，姜瑞文，夏滿瓊，周霞

(西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031)

山楂為薔薇科植物山里紅CrataeguspimiatificiaBge.var. major N, E. Br, 或山楂CrataeguspinnatifidaBge干燥成熟果實[1]，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂等功效。山楂炮制品主要有凈山楂、焦山楂、山楂炭等[2]。目前，針對山楂的研究主要是有機酸、黃酮等成分的含量檢測，以及對生品的指紋圖譜研究[3]，而對其炮制品成分整體變化的研究尚未見文獻報道。本研究擬采用HPLC法對山楂及其炮制品進行研究，建立指紋圖譜，旨在較全面反映山楂飲片整體質量，區分山楂飲片及不同炮制品，為山楂飲片質量控制提供實驗依據。

1 儀器與材料

安捷倫1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技中國公司)；YP2002型電子天平(常州市衡正電子儀器有限公司)；SB-4200D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-D3予華牌循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)。

5-羥甲基糠醛(5-HMF)對照品(批號：MUST-18031202)、綠原酸對照品(批號：MUST-18030620)、金絲桃苷對照品(批號：MUST-17101605)，純度均在99.00%以上，均購自成都曼思特生物科技有限公司。水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

共收集山楂飲片11批，見表1。焦品按照《中國藥典》2015年版一部[1]炮制方法制備，炭品按照《中國藥典》2015年版四部炮制通則[4]制炭方法制備，得到11批焦山楂及山楂炭。

表1 不同山楂飲片的采購信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參考文獻[3,5-6]并結合預實驗，采用以下色譜條件：Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為325 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；流動相為乙腈(A)，0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～10%A；15～30 min，10%～24%A；30～50 min，24%～40%A)。

2.2 對照品溶液的配制

稱取5-HMF、綠原酸、金絲桃苷對照品適量，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的配制

精密稱取山楂飲片粉末(過四號篩)1.0 g，置50 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲處理50 min，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取山楂飲片樣品(批號S1)1.0 g，按“2.3”項方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，結果共有峰保留時間RSD值均<1.0% ，峰面積RSD值均<1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密稱取山楂飲片樣品(批號S1)1.0 g，按“2.3”項方法制成供試品溶液，分別于0、3、6、12 h按“2.1”項色譜條件測定，結果共有峰保留時間RSD值均<1.0%，共有峰峰面積RSD值均<1.0%，表明供試品溶液在12 h內檢測穩定。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取山楂飲片樣品(批號S1)1.0 g，按“2.3”項方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結果共有峰保留時間RSD值均<1.0%，共有峰峰面積的RSD值均<1.0%，表明該方法重復性良好。

2.5 樣品指紋圖譜的建立

稱取11批山楂生品、焦品及炭品，按“2.3”項方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，色譜圖見圖1-3?？梢?，在生山楂圖譜中共標示出14個特征峰；在焦山楂圖譜中共標示出12個特征峰，與生山楂相比，其中包含10個共有峰及炮制后生成的2個新特征峰(峰1、峰16)；在山楂炭圖譜中共標示出10個特征峰，與生山楂相比，其中包括8個共有峰及炒炭后生成的2個新特征峰(峰1、峰16)。經與對照品確認，山楂飲片指紋圖譜中共歸屬2個特征峰，分別為綠原酸和金絲桃苷；焦山楂、山楂炭指紋圖譜中共歸屬3個特征峰，分別為5-HMF、綠原酸、金絲桃苷，見圖4。

84.6263.4742.3121.160.00mAUS11S114.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/min

14.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/minS11S1161.24121.1080.9740.830.70mAU

14.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/minS11S1179.97120.0260.470.92mAU

2.6 生山楂、焦山楂及山楂炭飲片指紋圖譜的比較

通過對比山楂及炮制品的指紋圖譜發現，14個峰均有一定變化。對比生山楂和焦山楂飲片指紋圖譜，其中有10個共有峰和2個新生成的峰，峰4、峰7、峰8、峰14幾乎消失，新生成峰1、峰16。對比生山楂和山楂炭飲片指紋圖譜，在生山楂飲片中峰面積相對較高的峰5、峰12、峰13在炒炭后峰面積分別降低了2、7、6倍，4號、7～9號、11號、14號色譜峰面積大幅度下降。山楂和山楂炭飲片指紋圖譜中有8個共有峰及2個新生成的峰，其中除峰10外，差異極為顯著，新生成峰1、峰16。炒炭前后色譜峰數目、峰面積均發生顯著變化。

ABCR

山楂炭與山楂飲片歸屬的特征峰相比，在山楂炭指紋圖譜中峰3(5-HMF)的峰面積相對較高。峰3、峰5、峰12在炒炭前后含量變化幅度極為顯著，由此推斷山楂炒炭后機理變化與這三種成分有密切關系。山楂飲片經炮制后，生成新物質5-MHF，但隨炮制程度逐漸分解，含量下降。綠原酸、金絲桃苷含量隨炮制程度逐漸下降，見表2。

表2 山楂炮制前后特征峰峰面積變化

2.7 相似度評價

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2012.130723版軟件，以S1的圖譜為參照，采用平均數法分別生成11批山楂飲片擬合圖譜(圖4)，以擬合圖譜為對照分析11批山楂生品及炮制品飲片樣品相似度，結果見表3。可見，不同批次的山楂飲片指紋圖譜相似度均較高(大于0.9)，說明市場上銷售的山楂質量較穩定。

表3 11批山楂飲片及其炮制品的指紋圖譜相似度評價

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本文考察了多種提取溶劑、提取次數(超聲次數)、提取時間[6-7]的提取效果，結果顯示提取方法為甲醇超聲提取50 min時，各色譜峰穩定且峰形較好，所以選擇甲醇為提取溶劑。同時考察了流動相、柱溫，發現采用0.1%乙酸水溶液和乙腈作為流動相，各色譜峰得到較好的分離，柱溫30 ℃特征峰分離度較好。

考察了238、254、265、295、305、325、355、390 nm 8個波長下的色譜圖[3,5]，結果顯示325 nm波長下山楂的圖譜信息量大，色譜峰多，基線平穩，分離度及峰形均較好，故選擇325 nm作為檢測波長。

3.2 指標成分的選擇

根據 11批山楂飲片及其炮制品HPLC圖譜分析，發現生品與焦品、炭品均有8個共有峰。在分析生品以及炮制品的共有峰時，選擇了響應值最高的5號峰(綠原酸)作為參照峰(S)，計算各共有峰的峰面積和保留時間，結果顯示共有峰保留時間的RSD小于 1%，由圖4可見各共有峰面積相差較大，表明各飲片成分相似，但共有成分的相對質量分數有一定差異。

綠原酸(有機酸類)、金絲桃苷(黃酮類)均為山楂生品中有效活性成分[8,13-15]，綠原酸有抗氧化、保護心血管等作用，金絲桃苷具有抗感染、對心、腦血管的保護作用等多種生理活性，而5-HMF為炮制品中主要活性成分，可能具有凝血作用[9-12]，以上3種成分在設立的指紋圖譜中都有較清晰的顯示，可作為指標性成分。

3.3 共有峰與相似度評價

本研究采用HPLC法建立了山楂不同炮制品的指紋圖譜，分別以山楂及炮制品的有效成分5-HMF、綠原酸、金絲桃苷為指標性成分，確立了8個共有峰。山楂相似度評價結果表明，11批供試品的 HPLC指紋圖譜相似度高，相似度大于0.9，符合中藥指紋圖譜的技術要求，各個共有峰出峰時間相對平穩，峰形理想，可將此作為控制山楂質量的依據之一。除指標成分外，還發現其他色譜峰面積也有改變，后續可對其成分開展進一步研究。