HPLC法快速測定九氣拈痛丸中α-香附酮和高良姜素的含量

★ 吳麗（樂山市食品藥品檢驗檢測中心 四川 樂山 614000）

九氣拈痛丸具有理氣、活血、止痛等功效，用于氣滯血瘀導致的胸脅脹滿疼痛、痛經(jīng)。有研究顯示采用耳穴貼壓法配合口服力氣拈痛丸治療氣滯血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)療效顯著［1］。九氣拈痛丸配方藥材包括醋香附、木香、高良姜、陳皮、郁金、醋莪術、醋延胡索、檳榔、甘草、五靈脂等十種中藥材。現(xiàn)代中藥質(zhì)量標準強調(diào)多組分、多靶點的質(zhì)量控制［2-3］，而九氣拈痛丸現(xiàn)行標準［4］含量測定僅采用HPLC法控制陳皮苷含量，質(zhì)量控制指標單一。加之當前市場上中藥材質(zhì)量參差不齊，控制多藥材中藥制劑質(zhì)量顯得很有必要。為增加九氣拈痛丸質(zhì)量控制內(nèi)容，參閱現(xiàn)行質(zhì)量標準和相關文獻，本文選取配方中占比較大的高良姜和醋香附為質(zhì)量控制對象，以高良姜素［5］和α-香附酮［6］為目標成分，采用常規(guī)C18柱，簡單二元流動相等度洗脫，超聲提取的方式，建立了高效液相色譜法測定九氣拈痛丸中α-香附酮和高良姜素含量的質(zhì)量控制方法，為有效快速控制九氣拈痛丸質(zhì)量提供了參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，DAD檢測器（美國）；XS205梅特勒-托利多電子天平（瑞士）；CQ-100B超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學器械廠）；ULPZY-250DROMB優(yōu)普系列純水設備（成都超純科技有限公司）；ULUP-II-10T優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

α-香附酮（批號：110748-201513，99.7%，中國食品藥品檢定研究院）；高良姜素（Lot：DST170215-020，≥99%，成都德思特生物技術有限公司）；九氣拈痛丸（市售，頸復康藥業(yè)集團赤峰丹龍藥業(yè)有限公司，批號1808048和1808053；北京同仁堂制藥有限公司，批號17082149；石藥控股集團河北永豐藥業(yè)有限公司，批號11618100314）。甲醇為色譜純和分析純，磷酸為分析純，試驗用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTerra?C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；以甲醇-0.05%磷酸溶液（67∶33）為流動相；檢測波長：249 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。對照品溶液、供試品溶液和陰性空白溶液的色譜圖見圖1，α-香附酮、高良姜素峰與相鄰峰分離度符合要求。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液制備 取α-香附酮對照品11.15 mg和高良姜素對照品10.90 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備溶液；精密吸取混合對照品貯備溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉碎均勻，取粉末約6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40kHz）60 min，放冷，再稱定重量，甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的配制 按處方配制不含香附和高良姜的陰性樣品溶液。

2.5 定量限試驗 分別精密稱取α-香附酮和高良姜素對照品，加甲醇溶解，并稀釋制成系列濃度溶液，按“2.1”方法進樣分析。根據(jù)信噪比（S/N）=10，得兩組分定量限分別為0.14 μg/mL和0.21 μg/mL。

2.6 線性與范圍考察 分別精密吸取“2.2”混合對照品溶液1 mL、2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得線性系列濃度溶液1；分別精密量取“2.2”混合對照品貯備溶液2、4、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得線性系列濃度溶液2；精密量取線性系列濃度溶液1、對照品溶液和線性系列濃度溶液2共6個溶液各10 μL，照“2.1”色譜條件測定峰面積。分別以兩組分濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：α-香附酮Y= 33.774X+3.344，（r =0.9999，n=6），范 圍2.22～177.84 μg/mL；高良姜素Y= 24.746X- 2.825（r=1.0000，n=6），范圍 2.18～174.40 μg/mL。

2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果：α-香附酮RSD（n=6）為0.8%，高良姜素RSD（n=6）為0.7%，顯示精密度良好。

2.8 重復性試驗 取批號為“1808048”的九氣拈痛丸樣品，照“2.3”項方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定。結(jié)果：α-香附酮和高良姜素的質(zhì)量分數(shù)分別為0.1369 mg/g和0.1403 mg/g，RSD（n=6）分別為1.5%和1.8%，顯示重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取6份已知含量的樣品（批號1808048，測得α-香附酮和高良姜素的含量分別為0.1367 mg/g和0.1402 mg/g）約3g，精密稱定，分別精密加入“2.2”項下混合對照品貯備液2 mL，再按“2.3”項下方法制備，精密吸取以上6種溶液各10 μL進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1，表明加樣回收率良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗 取“1808048”批樣品，按“2.3”項下方法處理，室溫條件下分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果：α-香附酮RSD（n=7）為0.5%，高良姜素RSD（n=7）為0.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 含量測定 分別取4批九氣拈痛丸，照“2.3”項下方法制備樣品溶液，每批平行制備3份，照“2.1”項下色譜條件測定，采用外標法計算，結(jié)果見表2。

3 討論

根據(jù)高良姜素和α-香附酮的紫外光譜圖進行分析，高良姜素在249nm波長處為波谷；α-香附酮在249nm波長處為波峰，波峰和波谷處曲線平緩，適用于作為測定波長，選擇249 nm波長較為合適。

本實驗采用HPLC法快速測定九氣拈痛丸中α-香附酮和高良姜素的含量，實驗中采用常規(guī)的C18色譜柱，直接通過超聲提取，過程簡單，色譜分析時間短。通過方法學驗證，方法專屬性高、精密度好、準確度高、簡單快速，可作為快速測定九氣拈痛丸中α-香附酮和高良姜素含量的方法。實驗中，收集三個廠家共4個批次樣品進行分析，α-香附酮的含量為0.128 7～0.284 4 mg/g，高良姜素的含量為0.140 2～0.228 3 mg/g，同一個廠家樣品間高良姜素和α-香附酮的質(zhì)量較穩(wěn)定，不同廠家間質(zhì)量差異較大，可能與藥材種類、生產(chǎn)地環(huán)境等多種因素相關［7］，對于制定九氣拈痛丸中高良姜素和α-香附酮的含量控制限度，樣本量遠遠不夠，可考慮收集更多的樣本，制定九氣拈痛丸的質(zhì)量標準。

表1 回收率試驗結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果