基于輻照場糖基化改性的大豆蛋白凍融穩定性提高研究

王喜波 王玉瑩 周 淼 姜 朔 付 玲

(東北農業大學食品學院, 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白是以低溫脫脂豆粕為原料，經堿溶酸沉法制備的全價蛋白質[1]。大豆分離蛋白應用于食品中不僅能提高產品營養價值，還可以調節功能特性[2]。在運輸儲藏中，乳液食品通常需要冷藏或冷凍來保證品質[3]或延長保質期，但乳液體系經過冷凍后，經常會出現脂肪聚結、冰晶析出、奧氏熟化等不穩定的現象，嚴重破壞了乳液的結構，使食品品質發生劣變[4]。大豆分離蛋白常用作乳化劑以維持乳液食品體系的穩定。天然大豆蛋白結構較為致密，在食品體系中乳化功能較差，必須對其進行適度改性才能滿足食品工業的要求。

美拉德反應是一種公認的蛋白質改性方法。糖的加入會改變蛋白的空間結構，使其柔性和疏水性增大，而復合物能迅速吸附至油水界面形成立體網絡，增加界面膜的厚度，抵抗外界環境造成的干擾[5]。輻照作為一種新興的冷處理方法，能夠最大程度保證食物的原有風味，同時還具有低能耗、低成本等優點[6]。2003年國際食品法典委員會規定，在保證食品結構的完整性、功能性和安全性的情況下，輻照劑量可大于10 kGy，這給輻照技術應用于食品行業提供了保障[7]。研究表明，輻照通過改變蛋白分子的結構進而改變蛋白質的功能特性。輻照后蛋白質的結構改變導致性質發生變化，增加輻射劑量，大豆分離蛋白乳化性提高[8]，α-螺旋含量下降，熒光光譜出現藍移[9]。經伽馬射線輻照后，紅豆分離蛋白蛋白質分子結構展開、疏水基團暴露，各種功能性質均有所改善，但輻照劑量進一步增加時，紅豆蛋白分子發生聚集，部分功能特性下降[10]。

目前，利用輻照技術輔助糖基化改性大豆蛋白的研究鮮有報道。本文利用γ射線輻照處理大豆分離蛋白與麥芽糖混合物，使其發生美拉德反應，進而改善大豆蛋白質乳液體系的凍融穩定性，旨在建立Box-Behnken模型、優化出抗凍融大豆分離蛋白，以擴大大豆蛋白在食品中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕，山東禹王實業有限公司;麥芽糖，湖北信康藥化有限公司;九三大豆油，黑龍江九三油脂有限責任公司;其他試劑均為分析純。

FJ300S型數顯高速分散均質機，上海隆拓儀器設備有限公司; 高壓均質機，常州市超力均質泵廠; 高速冷凍離心機，廣州吉迪儀器有限公司; 紫外可見分光光度計，菲勒儀器有限公司; 恒溫磁力攪拌器，天津合普公司；MS104TS型分析天平，上海花潮實業有限公司；數顯型恒溫水浴鍋，江蘇盛藍儀器制造有限公司；YS-100YS-100型生物顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司；FTIR-1500型傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技股份有限公司；掃描電子顯微鏡，德國卡爾蔡司公司；FD系列冷凍干燥機，上海豫明儀器設備廠。

1.2 試驗方法與指標測定

1.2.1大豆分離蛋白制備

根據文獻[11]所述方法，略有改進。將經60目篩磨碎的低溫脫脂豆粉與去離子水按料液比10 g/mL混勻2 h后調pH值至8.5，除去離心后的不溶物，用HCl調pH值至4.5，靜置2 h后離心得沉淀。洗滌3次后用NaOH調pH值至7.0，冷凍干燥后得大豆分離蛋白。

1.2.2輻照糖基化大豆分離蛋白制備

將大豆分離蛋白(SPI)與麥芽糖(M)以一定質量比(3、4、5)溶解于磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L、pH值7.0)中，充分混勻配制一定質量濃度(30、40、50 mg/mL)的溶液。靜置12 h使其完全水化。取樣品溶液置于60Coγ 輻射源下進行輻照反應(輻照劑量為5、7.5、10 kGy)。將輻照后樣品冷凍干燥即得輻照SPI-M(輻照糖基化大豆分離蛋白)。

1.2.3接枝度

根據文獻[12]所述方法，略有改進。將40 mg鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇、25 mL的0.1 mol/L四硼酸鈉后，分別加入2.5 mL質量分數為20%的SDS(十二烷基硫酸鈉)和100 μL β-巰基乙醇，混勻后用超純水定容至50 mL即為OPA試劑，OPA試劑現配現用。將4 mL OPA試劑與200 μL樣品溶液混合放入35℃水浴鍋中反應2 min后于340 nm處測吸光度，以去離子水作空白。接枝度計算公式為

(1)

式中A1——接枝反應前溶液吸光度

A2——接枝反應后溶液吸光度

1.2.4傅里葉紅外光譜

根據文獻[13]所述方法，略有改進。將樣品粉末壓制成薄片放于樣品臺的金剛石ATR(衰減全反射)附件上，調分辨率為4 cm-1，掃描次數8次，測量范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5乳化性

根據文獻[14]所述方法，略有改進。取30 mL 2 mg/mL樣品溶液與10 mL大豆油以轉速11 000 r/min均質1 min后，分別于0 min和10 min在底部取100 μL分散在10 mL的SDS中，于500 nm測吸光度。乳化活性指數和乳化穩定性指數計算公式為

(2)

式中A0——0 min時的吸光度

T——常數，取2.303

N——稀釋倍數，取100

φ——體系中油相所占的體積分數，取25%

C——蛋白質的質量濃度，g/mL

L——比色池光徑，cm

(3)

式中A10——10 min時的吸光度

ΔT——時間差，取10 min

1.2.6乳析指數

取90 mL樣品溶液與10 mL大豆油以轉速11 000 r/min均質3 min后再60 MPa高壓均質形成微乳液。將乳液于-22℃冰箱中冷凍22 h后在水浴鍋中解凍，進行3次凍融循環[15-16]。乳析指數計算公式為

(4)

式中HS——乳清層高度，cm

HT——乳液總高度，cm

1.2.7出油率

根據文獻[17]所述方法，略有改進。將8 g樣品乳液和2 g蘇丹Ⅲ油溶液充分混合以10 000 r/min離心20 min后取上清液于508 nm測定吸光度，大豆油為空白。出油率計算公式為

(5)

式中m0——蘇丹Ⅲ油溶液的質量，g

me——乳液的質量，g

a——離心前后蘇丹Ⅲ油溶液吸光度比值

φd——乳液中油相質量分數，取20%

1.2.8掃描電鏡觀察分析

取一定量凍干后的樣品，采用導電膠貼于載物臺上，并使用離子濺射儀鍍金。之后在S-3500N型掃描電子顯微鏡放大3 000倍下觀察樣品的微觀形貌，加速電壓為5 kV。

1.2.9光學顯微鏡觀察分析

根據文獻[18-19]所述方法，略有改進。將凍融后的樣品乳液搖勻后取8 μL置于載玻片中，蓋上蓋玻片后置于顯微鏡的觀察區，調整倍數為400倍來觀察樣品乳液微觀狀態。

1.2.10輻照SPI-M制備工藝優化

根據單因素試驗的結果[20]，接枝度與第1次凍融后的乳析指數Pearson相關系數為-0.915，呈顯著負相關，以其為響應值，以SPI與M質量比、SPI質量濃度和輻照劑量為變量，設計Box-Behnken試驗方案，優化高凍融穩定性大豆蛋白制備工藝，因素編碼見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素與編碼Tab.1 Box-Behnken experimental factors and codes

1.3 數據統計分析

所有試驗均重復3次，采用SPSS 19.0軟件進行試驗數據分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，采用PeakFit 4.12軟件對紅外光譜進行擬合計算，采用OriginPro 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果與分析

2.1.1試驗結果

在前期單因素試驗基礎上[20]，對SPI與M質量比、SPI質量濃度和輻照劑量3個因素進行優化，以接枝度和第1次凍融后的乳析指數為響應值設計三因素三水平的響應分析試驗，共17個試驗點，其中12個為析因點，5個為零點，析因點為自變量取值在X1、X2、X3(SPI與M質量比、SPI質量濃度、輻照劑量的編碼值)所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，其中零點試驗重復5次，以估計試驗誤差。結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗結果Tab.2 Experimental results of Box-Behnken experiment

2.1.2模型建立及顯著性檢驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行回歸擬合，得到響應值對SPI與M質量比、SPI質量濃度和輻照劑量3個因素的回歸方程為

表3 Box-Behnken 試驗方差分析Tab.3 Variance and significant analysis of Box-Behnken design test

為了更合理表現各因素交互作用對大豆分離蛋白凍融特性的影響，對各因素與響應面值構成的三維空間響應面圖進行分析。由圖2知，當SPI與M質量比、SPI質量濃度和輻照劑量中的1個因素固定在0水平時，另外2個因素都對接枝度和乳析指數有交互影響。由圖2a知，當輻照劑量一定時，隨著SPI質量濃度的增加，輻照SPI-M的接枝度先上升后下降，可能是因為蛋白分子含量的增加，加大了與麥芽糖分子的碰撞幾率，接枝程度增加，但蛋白含量過大導致反應體系黏度過大不利于發生美拉德反應[21]。當輻照劑量一定時，糖比例降低時，糖分子移動空間大，能迅速與蛋白分子發生接枝反應，接枝度增加，但糖進一步降低，不足以與蛋白質充分發生反應，接枝度下降[22]。同樣，當SPI與M質量比和SPI質量濃度一定時，隨著輻照劑量的增加，輻照SPI-M的接枝度依然呈現先上升后下降的趨勢，可能是因為輻照處理打開了蛋白分子的結構，增加了與糖的結合機率[23]。接枝度和乳析指數呈負相關，接枝度越大乳析指數越小[24]。由圖2b知，乳析指數隨SPI質量濃度和輻照劑量的增加呈現先下降后上升的趨勢，當SPI與M質量比減小的時候，也表現出了同樣的變化。可能是輻照處理改變了蛋白質分子的結構，隨著糖鏈的引入，增加了界面膜的機械強度，阻止了尖銳的冰晶對界面膜破壞，改善了凍融特性[25-26]。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，預測在穩定狀態下的最佳工藝條件為SPI與M質量比4.04、SPI質量濃度39.01 mg/mL、輻照劑量7.49 kGy。考慮到試驗條件的可操作性，將優化的最佳條件修改為：SPI與M質量比4、SPI質量濃度40 mg/mL、輻照劑量7.5 kGy。在此條件下進行3次驗證性試驗，接枝度平均值為34.56%和第1次凍融后的乳析指數平均值為27.18%，模型預測值接枝度為34.55%和第1次凍融后的乳析指數為27.16%，證明本模型優化工藝參數可靠，具有實用價值。

圖1 預測值和實測值的對照圖Fig.1 Comparison of predicted and observed values

2.1.3響應面分析與優化

圖2 各因素對大豆分離蛋白凍融特性的影響Fig.2 Effect of various factors on freeze-thaw properties of soy protein isolate

2.2 不同樣品凍融特性分析

在冷凍和解凍處理之后，由于油相和水相之間的密度差異，乳劑顯示出乳化或沉降現象，乳液中的不穩定性主要歸因于冷凍過程中冰晶形成的不穩定效應[3]。本試驗設定了SPI和SPI+M(無輻照)2個對照組，分析進行3次凍融循環后樣品的凍融特性。由表4可知，經過凍融循環后，樣品乳液的乳析指數顯著增加，尤其是SPI。單純添加麥芽糖的SPI+M對比SPI凍融特性雖有改善，但效果不明顯。而輻照SPI-M在經歷凍融循環后，乳析指數相對穩定，表現出較好的凍融特性。對比SPI，乳析指數分別降低了22.98、28.40、30.70個百分點。可能是因為輻照打開了蛋白分子的結構，釋放了更多的游離氨基，增加了與糖分子的碰撞機會，引入的糖鏈在界面膜附近形成立體網絡，增加了界面膜的厚度，抵抗形成的冰晶對界面膜的破壞，防止液滴間的聚集，其凍融穩定性顯著提高[23,27]。文獻[28]的研究表明，多糖可以吸附到蛋白質層形成較厚的界面膜，增加乳液的穩定性。

表4 SPI、SPI+M及輻照SPI-M乳析指數分析Tab.4 SPI, SPI+M and irradiated SPI-M creaming index analysis %

表5為SPI、SPI+M及輻照SPI-M的乳化性和經歷凍融后的出油率變化。由表5可知，輻照SPI-M乳化活性和乳化穩定性比SPI和SPI+M要好，而SPI和SPI+M乳化性相差不大，說明單純的添加糖并不會對乳化性有所改變。文獻[29]也表明蛋白質-糖綴合物的乳化性能優于蛋白質和糖的混合物。輻照SPI-M的乳化活性指數和乳化穩定性指數對比SPI分別提高了9.26 m2/g和3.76 min。可能是因為輻照處理引入糖鏈，溶解性增加，進而提高了乳化性[22]。出油率是表征凍融特性的重要指標之一，出油率越低，乳液越穩定[30]。可從表5明顯看出，歷經凍融循環后，SPI和SPI+M出油率急劇增加，SPI+M比SPI雖有降低，但總體改善不大。輻照SPI-M具有較低出油率，與SPI相比，出油率分別降低了9.7、21.2、26.4個百分點。可能是因為乳化性增加，減少了油滴的碰撞，穩定了乳液[31]。

表5 SPI、SPI+M及輻照SPI-M乳化性和出油率分析Tab.5 Analysis of emulsification and oiling off of SPI, SPI+M and irradiated SPI-M

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜是分析糖是否與蛋白質共價相連的重要手段之一，光譜圖吸收峰的變化與樣品各基團的改變相對應。紅外光譜圖上—OH基團在3 700～3 200 cm-1處出現較寬的伸縮振動峰，C—N鍵在1 260～1 000 cm-1處出現較強的振動[32-33]。由圖3可知，與SPI對比，輻照SPI-M在1 260～1 000 cm-1范圍內出現了較強的振動，新吸收峰出現，說明C—N鍵的數量增加，新生成了C—N基團，證明大豆分離蛋白與麥芽糖是以共價鍵的方式結合[34]。文獻[35]通過超聲波和微波輔助糖基化制備大豆分離蛋白-葡聚糖綴合物，傅里葉變換紅外分析證明大豆分離蛋白和葡聚糖通過美拉德反應形成了共價鍵。與SPI對比，輻照SPI-M在3 700～3 200 cm-1處出現了較寬的吸收峰，是由—OH的伸縮振動引起的，表明大豆分離蛋白與麥芽糖發生美拉德反應后，糖分子的接入使輻照SPI-M的親水性羥基數量增加。SPI+M混合物的紅外光譜中并未在3 700～3 200 cm-1處出現較寬的吸收峰，表明單純的混合糖后，SPI結構并未產生新的基團。

圖3 SPI、SPI+M及輻照SPI-M紅外光譜圖Fig.3 SPI, SPI+M and irradiated SPI-M infrared spectroscopy

2.4 掃描電鏡分析

蛋白質的微觀結構變化影響其功能性質，掃描電鏡圖像可以提供樣品精細的表面形貌。圖4為凍干后未經處理的SPI和輻照SPI-M的放大3 000倍的微觀結構圖。從圖中可見輻照處理前后大豆分離蛋白的微觀結構具有明顯的區別。大豆分離蛋白在未處理之前表面平滑，而輻照SPI-M表現為出現細小空隙的凹洞，呈蜂窩狀，形成疏松孔洞，呈現出良好的持水性。文獻[36]也支持本文假設，即均勻的網狀空間結構有利于吸水能力的提高。文獻[37]表明大豆分離蛋白與葡聚糖緊密結合，得出了與本文相似的結果。

圖4 SPI及輻照SPI-M微觀結構Fig.4 SPI and irradiation SPI-M microstructure

2.5 光學顯微鏡分析

圖5為SPI及輻照SPI-M乳液凍融前后的光學顯微結構，由圖5可知，SPI和輻照SPI-M初始乳液并沒有出現明顯區別，但經過冷凍處理后，可明顯看出SPI出現許多較大油滴和團塊，可能是因為冷凍后，乳液中水分遇低溫體積變大，形成尖銳的冰晶刺破界面膜，油滴滲透聚集形成大油滴[38]。而輻照SPI-M只出現部分小油滴，乳液性質穩定。文獻[35,39]的研究結果也表明糖基化改性產物在凍融后表現出相對穩定的狀態。

圖5 SPI及輻照SPI-M乳液凍融前后的光學顯微結構Fig.5 Optical microstructures of SPI and irradiated SPI-M emulsion before and after freeze-thaw

3 結束語

利用Design-Expert 8.0.6軟件設計建立Box-Behnken模型，對輻照場下糖基化改性制備高凍融穩定性大豆蛋白工藝進行了優化，得出最佳制備條件為：SPI與M質量比4、SPI質量濃度40 mg/mL、輻照劑量7.5 kGy。在此條件下得到的改性SPI與對照SPI相比，乳析指數分別降低了22.98、28.40、30.70個百分點，出油率分別降低了9.7、21.2、26.4個百分點。乳化活性指數和乳化穩定性指數對比SPI分別提高了9.26 m2/g和3.76 min。說明該模型合理、可靠，能夠改善大豆分離蛋白的凍融性。紅外光譜表明，大豆分離蛋白與麥芽糖發生美拉德反應。掃面電鏡表明，輻照SPI-M呈蜂窩狀，具有良好的持水性。光學顯微鏡分析表明，在冷凍和解凍處理之后，輻照SPI-M乳液更穩定。說明采用輻照處理能使大豆分離蛋白與麥芽糖發生美拉德反應，并改善大豆分離蛋白凍融特性。