溶解曲線法與培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼、利福平耐藥的臨床價值分析

河南省信陽市第五人民醫(yī)院（464000）張寧 王海燕 何小帆

我國屬于耐多藥結(jié)核病發(fā)病率的首位國家，目前治療此疾病的一線藥物則為利福平、異煙肼兩種，且也為診斷耐多藥結(jié)核病的依據(jù)，檢測其耐藥性對臨床及時診治耐多藥結(jié)核病有重要作用。以往多采用培養(yǎng)法進行檢測，此方式操作復(fù)雜、檢測時間長。隨著醫(yī)學(xué)界檢測技術(shù)發(fā)展，分子生物學(xué)診斷方式逐步在臨床得到應(yīng)用，溶解曲線法則為近年來不少學(xué)者主張的首選檢測其耐藥性的方式之一[1]。現(xiàn)納入116例結(jié)核病患者討論此點。

1 資料及方法

1.1 一般資料 隨機從我院2018年3月～2019年3月期間收治的結(jié)核病患者中抽取116例，116例中包含男性60例，女性56例，年齡21～67歲，平均為（35.8±1.2）歲，結(jié)核病病程時間0.3月～4個月，平均為（1.4±0.3）個月?；颊呔鶟M足《WHO耐藥結(jié)核病治療指南(2016更新版)》[2]中結(jié)核病診治標(biāo)準(zhǔn)，均自愿接受此次檢測。收集患者膿液、灌洗液、腦脊液、胸腔積液、痰液等進行培養(yǎng)后，顯示為結(jié)核分枝桿菌陽性，再用培養(yǎng)法和溶解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥性檢測。

1.2 方法 此次檢測金標(biāo)準(zhǔn)為傳統(tǒng)培養(yǎng)法，計算符合率、特異度、靈敏度等，進而評估溶解曲線法測定利福平、異煙肼的作用。

檢測方法：培養(yǎng)法采用WHO/IUATLD組織制定的比例閥，基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照均為無淀粉改良羅氏培養(yǎng)基，檢測利福平、異煙肼藥物敏感性。異煙肼藥物終濃度為0.2ug/ml，利福平藥物終濃度為40ug/ml。取菌液10-4mg/ml和10-2mg/ml，將其接種到含藥培養(yǎng)基和對照表面，再將其放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（溫度36℃）進行培養(yǎng)。1個月后出結(jié)果。若試驗管菌落數(shù)/對照管菌落數(shù)結(jié)果高于1%，則可判定為耐藥。

檢測耐藥突變：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種為標(biāo)本，用PCR溶解曲線法檢測，整個過程按試劑說明書進行操作，提取NDA后，做擴增處理，并確定陽性、陰性對照。

儀器設(shè)備自動評估讀出Tm值，比較陽性對照和檢測標(biāo)本兩者間Tm值，進而評估有無突變。野生型：若陽性對照熔點與4通道內(nèi)樣品點相符，菌株對利福平或異煙肼敏感；突變型：陽性對照高于任意通道內(nèi)熔點2℃或以上，菌株對利福平或異煙肼耐藥。

1.3 指標(biāo)判定 本研究各檢測均需由醫(yī)院檢驗科2名專業(yè)且工作經(jīng)驗豐富者負(fù)責(zé)，全程無需他們協(xié)助，若發(fā)生意見分歧，可查閱相應(yīng)資料和文獻，共同商討得出結(jié)果，以確保檢測的客觀性、準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用統(tǒng)計學(xué)軟件（SPSS13.0版本）分析數(shù)據(jù)，X2檢驗檢測結(jié)果（%），用符合率、特異度、靈敏度評估溶解曲線法檢測作用，若P<0.05，則有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異煙肼耐藥結(jié)果 溶解曲線法顯示34株耐藥，82株敏感；培養(yǎng)法顯示29株耐藥，77例敏感，兩種方式檢測結(jié)果差異小（P>0.05），金標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)法，溶解曲線法檢測特異度為96.43%（81/84），敏感度為96.88%（31/32），符合率為99.14%（115/116），1株不符。見附表1。

附表1 比較異煙肼耐藥結(jié)果

2.2 利福平耐藥結(jié)果 溶解曲線法顯示24株耐藥，92株敏感；培養(yǎng)法顯示19株耐藥，97例敏感，兩種方式檢測結(jié)果差異?。≒>0.05），金標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)法，溶解曲線法檢測特異度為94.85%（92/97），敏感度為100.00%（19/19），符合率為95.69%（111/116），5株不符。見附表2。

附表2 比較利福平耐藥結(jié)果

3 討論

近年受多種因素影響，結(jié)核分枝桿菌耐藥有所攀升。降低耐藥結(jié)核病持續(xù)傳染的主要措施則為及時診治。異煙肼、利福平兩類藥物為治療結(jié)核病的一線且常用藥物[3]，是否敏感對治療療效有直接影響，此則涉及到檢測其耐藥性。以往采用的培養(yǎng)法，已發(fā)展為檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，但也因其檢測時間長，逐步無法滿足疾病診治需求，且對檢測條件要求高，操作復(fù)雜[4]，無法在基層醫(yī)院實施，此對持續(xù)推廣培養(yǎng)法測定結(jié)核分枝桿菌耐藥有較大局限性。結(jié)核分枝桿菌緩慢生長的特征對臨床及時診治疾病存在限制，因此，探尋一種簡便、快速、敏感、特異的結(jié)核病耐藥診斷方式為目前控制結(jié)核病傳染和提升治療效果的主要任務(wù)。

隨著醫(yī)學(xué)界各項技術(shù)改進，溶解曲線法逐步進入人們視線，且已在臨床得到認(rèn)可。將其用于檢測結(jié)核耐藥菌種，具有低污染、可重復(fù)、敏感性高、檢測速度快等優(yōu)勢[5]，但也存在操作復(fù)雜、成本高、設(shè)備條件需求高等缺陷，也暫未得到廣泛推廣。我院引進基礎(chǔ)為溶解曲線法的檢測結(jié)核耐藥突變的試劑盒，檢測成本得到明顯降低，且儀器可自行顯示結(jié)果，操作簡單，現(xiàn)已在臨床得到認(rèn)可。本研究中共討論結(jié)核分枝桿菌分離株116株，結(jié)果顯示，培養(yǎng)法和溶解曲線法兩者在對利福平和異煙肼耐藥性檢測的特異度和靈敏度方面一致性較好，提示溶解曲線法在測定結(jié)核患者利福平、異煙肼藥物耐藥上也具有較大優(yōu)勢。但溶解曲線法在檢測過程中，無法篩選氨基酸序列，僅對核酸序列有用[6][7]，所以，可能會將不導(dǎo)致氨基酸變化的突變判定成突變。此外，此方式無法從方法上區(qū)分突變具體位點，所以結(jié)果顯示為突變，無法絕對的將其判定為耐藥[8]。溶解曲線法屬于檢測結(jié)核病藥物耐藥的新型方式，其結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法一致性高，可節(jié)省檢測時間，3h則可完成檢測，此為診治結(jié)核疾病贏得了時間，也對控制疾病傳染有較大意義。

綜上，檢測結(jié)核病患者利福平、異煙肼藥物耐藥狀況，可采用溶解曲線法，此方式檢測敏感度、特異度、符合率均較高，臨床應(yīng)用價值大。