高遷移率族蛋白B1在伴有神經浸潤胃癌組織中的表達及意義

拓婷，朱飛虎

延安市人民醫院肛腸科，陜西 延安 716000

胃癌是臨床上消化道腫瘤中最常見的類型，調查顯示胃癌的年發生率為138.6/10 萬，且其病死率在所有癌癥致死病因中僅次于呼吸系統惡性腫瘤而居第2位[1]。胃癌的臨床特點包括發病率及轉移率高、病死率高，早期診斷率低等，其治療效果不佳也多與轉移率高關系密切[2]。神經浸潤(PNI)目前被認為是一種新的腫瘤轉移途徑，是指腫瘤周圍神經被侵及、包繞，或者瘤細胞直接進入到神經纖維間隙，從而造成腫瘤的轉移擴散[3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種僅合成或表達于增殖細胞中的核內多肽，既往臨床重多重視其在炎癥反應中的作用，現在認識到其在多種腫瘤組織尤其是轉移瘤中具有高表達的特點，可通過促進腫瘤細胞侵襲遷移而引起腫瘤的轉移、進展[4]。目前關于胃癌PNI 與HMGB1 關系的臨床研究尚不多見，因此本研究分析了HMGB1在伴有PNI的胃癌組織中的表達及臨床意義，現將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析延安市人民醫院2017 年 2 月至 2019 年 2 月期間收治的 82 例胃癌患者的臨床資料。納入標準：①年齡≥18 歲；②術前均經病理檢查證實為胃癌，術后病理進一步證實；③術前未接受放化療及生物免疫等手段治療；④臨床及病理資料完整。排除標淮：①合并嚴重的免疫系統疾病以及長期應用免疫抑制劑治療者；②合并其他臟器、系統的嚴重病變，或其合并其他惡性腫瘤者。82例患者中男性49例，女性33例；年齡52～84歲，平均(64.1±10.2)歲。

1.2 研究方法 所有患者均接受胃癌根治術治療，收集患者的臨床及病理資料，根據術后病理結果將伴有PNI 的38 例患者納入觀察組，余44 例未伴有PNI 者納入對照組。比較兩組患者的性別、年齡、飲酒、吸煙以及高血壓、糖尿病等臨床資料。飲酒標準：飲酒史＞3 年，≥100 mL/d；吸煙標準:吸煙史＞5年，≥20支/d。同時測定所有患者的胃癌組織HMGB1的表達，對PNI胃癌患者再次分組，根據HMGB1表達是否陽性將患者分別納入陽性組和陰性組，比較兩組患者的性別、年齡、臨床分期及腫瘤大小、臨床分期、是否有淋巴結轉移等臨床和病理特征。其中臨床分期的依據為國際抗癌聯盟TNM分期標準。

1.3 HMGB1表達的測定

1.3.1 免疫組織化學方法 手術結束后將胃癌組織送檢病理科，制備石蠟切片，進行免疫組化染色。采用Envision 兩步法，陰性對照選擇磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗。首先將石蠟包埋的組織進行4 μm的連續切片；使用二甲苯脫蠟，再使用梯度酒精進行逐級水化；將其放置在3%雙氧水、甲醇室溫下予以作用30 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；然后使用乙二胺四乙酸緩沖液進行抗原熱修復，時間為90 s；加入一抗HMGB1，放置在4℃條件下孵育過夜，使用PBS 充分沖洗；加入Envision 二抗，在室溫下孵育30 min；在光鏡下用二氨基聯苯胺(DAB)進行顯色，蘇木精復染、脫水、風干及封片等步驟，封片材料為中性樹脂。其中鼠單克隆抗體HMGB1 由北京博奧森生物技術有限公司提供，二抗、DAB、PBS等試劑由福州邁新公司提供。

1.3.2 陽性結果的判讀 HMGB1蛋白陽性表現為顯微鏡下細胞核或者細胞質內呈現呈棕色，觀察顯色癌細胞比例和染色強度，然后進行半定量化評分，標準：腫瘤組織內未發現棕色染色組織，或≤10%細胞膜/漿/核染色時判定為(-)；腫瘤組織出現＞10%細胞膜/漿/核部分染色，則判斷為陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0 統計學軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間均數比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組患者的臨床資料比較 觀察組和對照組患者在性別、年齡、飲酒、吸煙及合并高血壓方面比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；但是觀察組患者合并糖尿病的比例明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 觀察組和對照組患者的臨床病理資料比較

2.2 觀察組和對照組患者的HMGB1表達水平比較 HMGB1蛋白表達在顯微鏡下細胞質或細胞核內呈現棕色見圖1 和圖2。觀察組中有28 例HMGB1 表達陽性，陽性率為73.68%，明顯高于對照組的47.73%(21/44)，差異具有統計學意義(χ2=5.173，P＜0.05)。

圖1 細胞質中HMGB1的表達（×200）

圖2 細胞核中HMGB1的表達（×200）

2.3 觀察組患者HMGB1表達與臨床病理指標的關系 觀察組患者中，HMGB1陽性組與陰性組的年齡、性別比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；但是陽性組患者腫瘤直徑≥3 cm、TNM Ⅲ～Ⅳ、淋巴結轉移的比例明顯高于陰性組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 觀察組患者HMGB1表達與臨床病理指標的關系

3 討論

胃癌在我國是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，其發病率出現逐年上升的趨勢，已經成為威脅我國居民健康及生命安全的重要疾病[5]。胃癌患者早期常常缺乏典型臨床癥狀，一旦發病則出現快速進展，患者就診時常常處于中晚期[6-7]。近些年來，惡性腫瘤神經浸潤的機制及意義不斷被深入研究，臨床上也越來越重視PNI 在惡性腫瘤中的重要意義[8]。目前研究認為PNI 是惡性腫瘤的一種新的轉移方式，可能獨立于既往的血道轉移、淋巴轉移、種植轉移以及直接轉移，且與惡性腫瘤的預后關系密切。目前胃癌PNI的具體機制尚不明確，但是研究指出合并PNI 的胃癌患者其預后更差[9]。周樂盈等[10]對413 例胃癌患者的臨床資料并進行回顧性分析，指出神經浸潤與腫瘤的進展密切相關，對胃癌患者預后評估有著重要的作用。本研究對比了合并PNI的觀察組與未合并PNI的對照組的臨床資料，發現觀察組合并糖尿病的比例明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。既胃癌PNI 的發生與年齡、性別及飲酒、吸煙、高血壓等因素無明顯的相關性，但是糖尿病與PNI的發生可能存在關聯，說明胃癌患者如合并糖尿病則增大了其發生神經浸潤的風險。分析其原因可能是因為糖尿病患者長期存在高血糖狀態加重了其神經病變，進而導致了神經浸潤的發生，患者也更容易發生PNI[11]。

高遷移率族蛋白B1常位于真核生物的細胞核內，是一種生物學功能多樣的核內蛋白。既往認為HMGB1 在細胞外具有強大的致炎效應，且被認為是新型的炎性細胞因子之一[12]。隨著對HMGB1研究的深入，發現HMGB1 在核內主要與DNA 結合，不僅可以起到穩定核小體結構的作用，還與DNA的一系列生命活動關系密切如參與重組、修復、調控等[13]。此外，HMGB1 與腫瘤關系密切，通過結合不同受體可以發揮不同作用如促進基質降解、誘發新生血管形成、調節神經軸突生長能力等，進而促進腫瘤的發生、發展以及腫瘤的轉移等過程[14-15]。既往有研究指出，HMGB1 與肝癌者的臨床分期、分級密切相關[16]。CHUANG 等[17]觀察了胃癌患者血清HMGB1 濃度與臨床與病理指標的關系，發現患者血清HMGB1 水平與胃癌腫塊大小、淋巴結轉移及患者的預后均存在顯著的相關性。在本研究中，觀察組胃癌組織HMGB1的陽性表達率為73.68%，明顯高于對照組的47.73%，差異有統計學意義(P＜0.05)。另一方面，在伴有PNI胃癌中，HMGB1 陽性組與陰性組比較，年齡、性別差異無統計學意義(P＞0.05)；但是陽性組其腫瘤直徑≥3 cm、TNM Ⅲ～Ⅳ、淋巴結轉移的比例均明顯高于陰性組，差異有統計學意義(P＜0.05)，這進一步提示HMGB1可能參與了胃癌PNI的發生與發展。

綜上所述，合并糖尿病的胃癌患者可能更容易發生神經浸潤；而神經浸潤胃癌組織中HMGB1 的表達高于未伴有PNI的胃癌組織，且其與腫瘤大小、臨床分期及淋巴結轉移關系密切，有望成為胃癌的靶向治療及預后評估中的新的指標。