HIV/AIDS患者抗反轉(zhuǎn)錄治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞中HIV-DNA檢測(cè)臨床意義

劉 苑 潘克女 張永樂 徐愛芳 郁文燕

艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是一種由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的致死率較高的感染性疾病，已成為全球范圍內(nèi)公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題[1]。聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署2018年報(bào)道，2017年全球有約3690萬人感染艾滋病病毒(HIV)，其中180萬人為新感染HIV，較2001年新發(fā)感染約340萬例相比下降47%[2]。這與近年來HIV病毒感染的早期診斷和抗反轉(zhuǎn)錄治療(antiretroviral therapy，ART)密切相關(guān)[3,4]。ART是目前對(duì)抗HIV感染的主要手段，然而停藥后病毒再次復(fù)制，體內(nèi)HIV-RNA病毒載量迅速反彈,近年來研究者認(rèn)為HIV病毒與宿主細(xì)胞基因組以整合和非整合的形式存在，這些以DNA分子存在的HIV“病毒儲(chǔ)存庫(kù)”直接決定了病毒能否被徹底清除，也與患者病程進(jìn)展相關(guān)[5]。為了解HIV/AIDS患者ART前后外周血單個(gè)核細(xì)胞中HIV-DNA載量的變化，對(duì)50例HIV/AIDS患者ART前和ART 48周時(shí)HIV1型病毒感染者進(jìn)行HIV1-DNA、HIV1-RNA以及CD4+淋巴計(jì)數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

1.研究對(duì)象:2017年1月～2018年12月在杭州市西溪醫(yī)院就診的艾滋病感染者50例患者在本次就診前均未采用抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療。HIV1感染診療標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)AIDS學(xué)組2018年版的AIDS診療指南[6]，50例采用ART的患者中男性35例，女性15例，患者年齡20～50歲，患者平均年齡33.5歲，用藥方案：齊多夫定(AZT)0.3g口服，2次/天；拉米夫定(3TC)：0.3g口服，1次/天；司他夫定(D4T)：30mg口服，2次/天；奈韋拉平(NVP)：0.2g口服，1次/天；依非偉倫(EFV)：600mg口服，1次/天。接受AZT+3TC+NVP治療的患者35例，接受D4T+3TC+NVP治療的患者6例，接受AZT+3TC+EFV治療的患者6例,3例患者接受D4T+3TC+EFV治療；所有病例均經(jīng)杭州市疾病預(yù)防中心確診為HIV1感染。受試者采血前簽署知情同意書，且研究已獲杭州市西溪醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.儀器和試劑：美國(guó)AB7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf冷凍離心機(jī)，上海精宏產(chǎn)恒溫水浴鍋，德國(guó)Eppendorf移液器。美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特FC500流式細(xì)胞儀。廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)HIV1-RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒(檢出下限為50IU/ml)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)T淋巴細(xì)胞亞群分類檢測(cè)試劑，HIV1-DNA試劑盒為本實(shí)驗(yàn)室自建方法，檢出下限為50copies/106PBMC，引物探針委托上海生工生物科技有限公司合成純化,引物探針詳見表1，其他原料購(gòu)自廣州藍(lán)博生物技術(shù)公司。

表1 HIV1-DNA TaqMan-MGB熒光探針PCR的引物與探針

3.HIV1-DNA病毒載量檢測(cè)反應(yīng)體系配比及反應(yīng)條件：采用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的反應(yīng)體系PCR mix 12μl(Buffer, Mg2+, dNTP),1.5UTaq酶1μl, 0.5μmol/L的上游引物、下有引物各0.5μl，0.1μmol/L的熒光探針1μl, ddH2O 8μl,模板2μl合計(jì)25μl。擴(kuò)增程序?yàn)? 激活UNG酶37℃ 5min,預(yù)變性95℃ 5min,擴(kuò)增95℃ 15s，58℃ 45s運(yùn)行55個(gè)循環(huán)。

4.標(biāo)本采集和處理:采集HIV感染者抗病毒治療前和抗病毒治療48周時(shí)的外周血，其中非抗凝血1支約3ml,EDTA抗凝血2支，每支約2ml。非抗凝血分離血清，取1ml血清編號(hào)后-70℃保存用于HIV1-RNA檢測(cè)。EDTA抗凝血1支采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行T細(xì)胞亞群檢測(cè)。另一只EDTA抗凝血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),得到PBMC后采用緩沖液溶解并在顯微鏡下計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)。將得到的PBMC溶液稀釋到1×106個(gè)/毫升編號(hào)后-70℃保存用于HIV1-DNA檢測(cè)。

結(jié) 果

1.50例HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-DNA變化:50例HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-DNA檢出率均為100%，但HIV1-DNA含量ART前為3.29(2.41,3.72)高于ART 48周時(shí)含量2.76(1.98,3.28)Lgcopies/106PBMC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.758,P<0.01)，詳見圖1。

圖1 HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-DNA變化

2.50例HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-RNA變化以及與HIV1-DNA相關(guān)性：50例HIV/AIDS患者ART前外周血HIV1-RNA含量4.28(4.05，4.95)LgIU/ml,HIV1-DNA檢出率100%,含量3.29(2.41，3.72)Lgcopies/106PBMC。ART 48周時(shí)外周血HIV1-RNA均<1.70LgIU/ml(50IU/ml)，HIV1-DNA檢出率仍為100%，含量2.76(1.98，3.28)Lgcopies/106PBMC。50例HIV/AIDS患者ART前后HIV1-DNA與HIV1-RNA含量呈正相關(guān)(r=0.627,0.415,P均<0.01)，詳見圖2。

圖2 HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-RNA與HIV1-DNA相關(guān)性

3.50例HIV/AIDS患者ART前后外周血T淋巴計(jì)數(shù)比較：50例HIV/AIDS患者ART前外周血T淋巴細(xì)胞CD4+計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+值明顯低于ART后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.728,6.254,P<0.01),ART后CD8+有所降低但與ART前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.209,P>0.05)，詳見表1。

表1 HIV/AIDS患者ART前后外周血T淋巴計(jì)數(shù)比較

4.50例HIV/AIDS患者ART前及后外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與HIV1-DNA含量相關(guān)性:50例HIV/AIDS患者ART前及后外周血CD4+計(jì)數(shù)與HIV1-DNA含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.396,P<0.05),詳見圖3。

圖3 HIV/AIDS患者ART前后外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與HIV1-DNA含量相關(guān)性

討 論

抗反轉(zhuǎn)錄治療(ART)是目前抑制HIV/AIDS患者體內(nèi)病毒復(fù)制的主要手段，ART抑制HIV-RNA病毒復(fù)制，提高外周血T淋巴細(xì)胞CD4+數(shù)量，改善患者免疫系統(tǒng)，減少因免疫損傷引起的多種機(jī)會(huì)性病毒感染的主要途徑，然而停藥后病毒反彈就是因?yàn)椤皟?chǔ)存庫(kù)”中的DNA分子轉(zhuǎn)錄出病毒基因RNA和信使RNA，合成的病毒蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下產(chǎn)生成熟的HIV顆粒從細(xì)胞表面釋放出來，感染其他CD4+T淋巴細(xì)胞。研究者認(rèn)為，抗病毒治療停藥時(shí)機(jī)體HIV-DNA含量高低對(duì)預(yù)測(cè)病毒反彈時(shí)間具有相關(guān)性，高HIV-DNA含量患者停藥后反彈的速度更快[7，8]。因此病毒庫(kù)持續(xù)存在成為HIV/AIDS患者徹底治愈的最大障礙。

目前對(duì)HIV1-DNA含量檢測(cè)主要采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[9～11]。本研究采用TaqMan-MGB熒光探針技術(shù)對(duì)50例HIV/AIDS患者ART前和ART 48周時(shí)外周血HIV1-DNA含量，HIV1-RNA含量，T淋巴計(jì)數(shù)進(jìn)行分析。在ART治療前后外周血PBMC中均能檢出HIV1-DNA，但是ART前HIV1-DNA含量顯著高于ART 48周時(shí)，這一結(jié)論與陳偉烈等研究結(jié)論一致[12]。目前的ART不能清除HIV1-DNA,相關(guān)文獻(xiàn)還表明HIV/AIDS患者外周血DNA儲(chǔ)存庫(kù)的大小與ART方案無相關(guān)性。本研究ART方案病例分配不均未能進(jìn)行不同ART方案間進(jìn)行比較。從HIV1-DNA含量分析在ART前50份標(biāo)本HIV1-DNA含量中位數(shù)為3.29Lgcopies/106PBMC高于何惠達(dá)等報(bào)道的3.08Lgcopies/106PBMC(1207.95copies/106PBMC),差別主要來源于檢測(cè)標(biāo)本類型[13]。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外周血PBMC中的HIV1-DNA總含量，而何惠達(dá)等研究是CD4+T淋巴中的含量,因此結(jié)果較筆者的數(shù)值要低。HIV1-RNA含量在ART前中位數(shù)為4.28LgIU/ml，而ART 48周時(shí)50例患者HIV1-RNA均<1.70LgIU/ml(50IU/ml)的最低檢出限。鄭煜煌等[14]對(duì)艾滋病ART 0、24、48周的HIV1-RNA報(bào)道顯示,ART 0周時(shí)平均含量為4.12LgIU/ml，24周時(shí)全部<1.70LgIU/ml，與筆者的研究結(jié)果極為相似。HIV/AIDS患者ART過程中T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)是最常用的手段，尤其以CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變已成為判斷ART療效的重要指標(biāo)之一，隨著ART進(jìn)程CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸升高，在ART 48周時(shí)很多患者CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到正常，而另一指標(biāo)CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)在整個(gè)ART過程中變化不明顯，從而使CD4+/CD8+比值也隨著CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高而升高。

本研究對(duì)ART前后HIV1-DNA與HIV1-RNA含量做相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)HIV1-DNA與HIV1-RNA呈正相關(guān)，且治療前HIV1-DNA與HIV1-RNA含量相關(guān)性優(yōu)于抗病毒治療48周，這與抗病毒治療48周時(shí)HIV1-RNA均低于50IU/ml(1.70LgIU/ml)相關(guān)。結(jié)論與陳偉烈等[12]研究略存在差異。陳偉烈等研究將治療前治療后數(shù)據(jù)統(tǒng)一分析，因此總的相關(guān)性降低，并且HIV1-RNA<1.70LgIU/ml的結(jié)果視為0，這也是降低正相關(guān)的另一原因。ART前后HIV1-DNA與CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)做相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，與CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果與陳偉烈等[12]研究結(jié)論一致。因此接受ART的HIV/AIDS患者當(dāng)HIV1-RNA減少到低于檢出限時(shí)，外周血PBMC中仍能檢出HIV1-DNA，這可能是HIV感染者ART停藥后病毒重新復(fù)制的主要原因。