RNAi沉默HPC2對鼻咽癌細胞遷移侵襲的影響及分子機制

吳 梅 丁 偉 唐 亮

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是起源于鼻咽上皮的頭頸部常見惡性腫瘤，東南亞和我國南部的珠江三角洲地帶是高發(fā)區(qū)[1]。生活習慣、遺傳和病毒感染被認為是3個重要的發(fā)病因素[2]。鼻咽癌具有易轉移的生物學特性，包括區(qū)域淋巴結及遠處轉移，是患者死亡的主要原因，也是臨床治療的熱點、難點問題[3]。篩選出鼻咽癌轉移的驅動基因，針對性靶向干預是攻破轉移的重要思路。

多梳基因蛋白家族(polycomb group of protein，PcG)與器官發(fā)育，細胞的增殖及分化調控，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[4]。其中人多梳蛋白2(human polycom 2,HPC2)又稱為染色盒同源物4(chromobox homolog 4, CBX4)是PcG家族核心成員之一，常與RING1等其他PcG蛋白形成復合體，抑制homeotic基因，維持重要的生理功能[5]。據(jù)相關研究顯示，HPC2與多種腫瘤預后相關，筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPC2表達是影響NPC放療預后的獨立危險因素。然而HPC2在鼻咽癌中的生物學功能尚不清楚，本研究旨在初步探討HPC2在鼻咽癌細胞遷移侵襲中的作用和分子機制。

對象與方法

1.對象:人鼻咽癌細胞株5-8F由江西省委腫瘤轉移與精準治療重點實驗室饋贈。RPMI1640、Optimum培養(yǎng)基和 RNAi Max 均購自美國Invitrogen公司。陰性對照 siRNA 及 HHPC2 靶序列siRNA 購自廣州銳博生物公司，#1siRNA 序列(正義鏈)5′-AGAUGAAGAUAGUCAAGAA-3′,(反義鏈)5′-UUCUUGACUAUCUUCAUCU-3′；#2siRNA序列(正義鏈)5′-AGUACGAGCUCAACAGCAA-3′,(反義鏈)5′-UUGCUGUUGAGCUCGUACU-3′；scrambled 為無干擾功能對照序列。

2.細胞培養(yǎng)及轉染：從液氮復蘇的5-8F細胞，接種于10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃的恒溫箱培養(yǎng)。先將處于對數(shù)生長期的細胞，接種于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的6孔板，使細胞在轉染日能夠達到約60%融合度。采用RNAi max進行細胞瞬時轉染，將實驗分為轉染無功能scrambled 序列的對照組和兩個特異性靶向HPC2的轉染組(#1siRNA和#2siRNA組)。于6孔板的每孔加入Optimum無血清培養(yǎng)基1.5ml，各孔用EP管配制如下轉染混合體系，A管：Optimum 250μl + RNAimax 5μl，輕柔混勻孵育5min;B管：Optimum 250μl +siRNA 5μl，輕柔混勻孵育5min，A加入到B管中，混勻后室溫孵育20min。緩慢滴加入相應孔中，6孔板輕微晃動搖勻。轉入5%CO2、37℃孵育箱，6h后換液，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24～48h 后用于后續(xù)實驗。

3.PCR及Western blot 法檢測HPC2的siRNA干擾效率：簡要步驟如下，TRIzol法提取細胞系總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度，反轉錄酶合成cDNA。引物均購自中美泰和生物公司。HPC2引物：Forward 5′-GCAGAGTGGAGTATCTGGTGA-3′，Reverse 5′-AGCTTGGCACGGTTGTCAG-3′；GAPDH引物：Forward 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，Reverse 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。先行RT-PCR，總反應體系50μl，95℃，預變性15min，95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。取擴增產物10μl，上樣緩沖液2μl，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，65V，30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照電泳結果。SYBR?Green mix(TaKaRa生物公司)進行qRT-PCR檢測，反應的條件同前，擴增產物用2-ΔΔCt法計算，與內參基因GAPDH校準得到檢測樣本的相對表達水平。

4.蛋白免疫印跡(Western blot)法：檢測轉染 siRNA-HPC2 后的5-8F 細胞的HPC2及EMT關鍵蛋白表達，簡述如下：RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白含量，試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司(Cat.no，23227)；配平后用4×的上樣緩沖液煮蛋白，按照每孔30μg上樣，經10% SDS-PAGE電泳，將膠上蛋白電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，PBST洗膜，配一抗：HPC2(Cat.no，A302-355A；Bethly，1∶1000)，Snail(Cat.no，#3879；CST，1∶1000)，E-cadherin(Cat.no，#3195；CST，1∶1000)，MMP9(Cat.no，#3852；CST，1∶1000)和內參β-actin(Cat.no，AP0060；Bioworld，1∶2000)，加至孵育盒的膜上，4℃ 孵育過夜，PBST洗膜，加 1∶10000稀釋的二抗室溫孵育1h，搖床洗膜，ECL(Cat no.P0018F，上海碧云天生物技術有限公司)化學發(fā)光后顯影，用Image lab軟件采集圖像，β-actin為內參，實驗重復3次。

5.細胞劃痕實驗：取對數(shù)生長期5-8F細胞，調整細胞濃度為5×105/個，鋪6孔板，每孔均勻鋪80%，用一次性20μl無菌移液吸頭勻速用力劃痕，用PBS洗去劃落的細胞，加入10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，每間隔6h拍照，鏡下測量各組細胞遷移距離，愈合率%=(0h劃痕距離-各測量時點劃痕距離)/0h劃痕距離。

6.細胞侵襲實驗：在有Matrigel膠的Transwell 小室中加入50μl 無血清培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中30 min，用于水化基膜，取消化后重懸的對照組和轉染組細胞，調整細胞濃度為3×104個/孔接種到上室中，在下室中加入500μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用PBS洗兩遍，甲醇固定下室20min，再用PBS洗2遍，1%結晶紫染色10min，緩慢流水中漂洗1min，晾干，高倍光鏡下統(tǒng)計穿過Matrigel膠的細胞數(shù)目。

結 果

1.siRNA轉染后鼻咽癌細胞HPC2的mRNA及蛋白表達：5-8F細胞轉染siRNA后HPC2的mRNA豐度明顯降低(圖1A)。qRT-PCR檢測結果提示,對照組HPC2的mRNA相對表達量為0.93±0.06，#1 siRNA組表達量為0.20±0.05，#2 siRNA組表達量為0.18±0.04。轉染組的mRNA表達量較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1B)。HPC2的蛋白水平也明顯降低(圖1C)。

圖1 在鼻咽癌5-8F細胞轉染靶向HPC2的siRNA后HPC2的mRNA和蛋白水平檢測

2.HPC2沉默后對鼻咽癌細胞劃痕愈合的影響：用平板劃痕實驗比較HPC2沉默后細胞遷移愈合能力的變化。對照組6、12、24h的愈合率分別為30.43%±1.83%、64.75%±3.36%、97.32%±2.54%；#1 siRNA組6、12、24h的愈合率分別為22.43%±2.57%、48.75%±2.76%、75.46%±2.28%；#2 siRNA組6、12、24h的愈合率分別為18.65%±3.07%、37.51%±2.12%、68.72%±2.62%。在6、12、24h時間點，與對照組比較，沉默組的劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 沉默HPC2基因對5-8F細胞劃痕愈合能力的影響

3.沉默HPC2后對鼻咽癌細胞侵襲能力的影響：用Transwell小室檢測比較5-8F細胞侵襲能力，72h后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組穿膜細胞數(shù)為320±32，#1siRNA-HPC2轉染組細胞數(shù)為190±28，#2siRNA-HPC2轉染組細胞數(shù)為138±21。與對照組比較，siRNA-HPC2沉默組的細胞穿膜數(shù)減少，侵襲性下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 沉默HPC2后對鼻咽癌細胞侵襲能力的影響(結晶紫，×100)

4.靶向沉默HPC2后對EMT信號通路的影響：轉染HPC2對5-8F細胞中EMT關鍵分子Snail、E-cadherin及MMp9表達的影響。Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，兩個siRNA-HPC2轉染組的轉錄因子Snail下調，上皮標志物E-cadherin表達上調，轉移標志物MMP9下調，提示HPC2沉默后5-8F細胞的EMT信號通路抑制，轉移活性下降。

圖4 HPC2靶向沉默后EMT通路關鍵分子Snail、E-cadherin、MMP9的變化

討 論

骨、肺、肝臟是鼻咽癌(NPC)最常見轉移部位。骨轉移以骨盆、脊柱、四肢骨常見。約25%的T4或N3期的患者發(fā)生遠處轉移[6]。EBV介導的NPC轉移及調控機制是目前研究的熱點[7～9]。NPC的5-8F細胞株是持續(xù)感染EB病毒的SUNE1細胞株的亞株，具有高轉移特性[10]。因此，5-8F是關于鼻咽癌轉移研究的理想細胞模型。

1997年Otte等首次發(fā)現(xiàn)HPC2基因，定位于17號染色體長臂的25.3位置，由560個氨基酸殘基組成，相對分子質量約61kDa。HPC2是一種低分子泛素修飾物，稱為泛素連接酶SUMO E3，它包含如下3個功能結構域：①氨基端染色質區(qū)域介導Pc蛋白與染色質結合；②位于羧基端的COOH盒，可以與RING1和核小體顆粒結合介導轉錄抑制；③位于羧基端與伴侶分子CtBP特異結合的6氨基酸基序[11]。CBX4的SUMO化作用可以介導蛋白質的亞細胞定位，也可以調節(jié)轉錄因子的活性，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。HPC2的轉錄本在人體正常組織中差別不大，但在不同腫瘤細胞株中存在較大差異，HPC2在骨肉瘤細胞、腸癌細胞表達量高，在Burkitt淋巴瘤中表達量卻很低[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPC2在鼻咽癌組織及5-8F細胞株有較高表達。

據(jù)相關研究報道，CBX4在不同腫瘤中的作用并不一致。在結直腸癌中，CBX4募集HDAC3到RUNX2啟動子抑制其轉錄，從而抑制結直腸癌轉移[14]。研究顯示，CBX4的癌基因樣促轉移作用，在腎透明細胞癌中，CBX4與HDAC1作用抑制KLF6抑癌基因啟動子活性，促進腫瘤生長轉移；在骨肉瘤中CBX4上調RUNX2促進其轉移，靶向CK1α/CBX4有望使伴有轉移的骨肉瘤患者獲益；通過Notch1信號通路增強乳腺癌侵襲性；促進肝細胞癌高轉移株MHCC97L的遷移與肺轉移；調控BMI1促進肺癌增殖進展和轉移[15～19]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默HPC2后，鼻咽癌細胞侵襲遷移能力降低，提示HPC2在NPC中可能具有促轉移作用。EMT通路是調控腫瘤轉移的經典下游信號通路，腫瘤驅動基因介導EMT通路是促進鼻咽癌轉移的重要途徑。Dong等[20]研究顯示，下調MLKL通過抑制EMT有效抑制鼻咽癌的侵襲轉移。本研究發(fā)現(xiàn)沉默HPC2表達，snail下調，上皮標志物上調，轉移標志物MMP9下調，提示HPC2可能通過Snail/Ecadherin/MMP9通路介導NPC 轉移，具體的相互作用機制有待于進一步研究。

綜上所述，本研究顯示在鼻咽癌5-8F細胞沉默HPC2表達，可抑制鼻咽癌細胞的遷移及侵襲能力，實驗結果還需深入開展動物實驗研究。以上證據(jù)支持HPC2可能作為治療鼻咽癌轉移的新分子靶點。