環狀RNA circ_0024707對乳腺癌細胞的生長和轉移的影響

楊杰智 倪明立 徐 倩 楊明月 王 寧 呂紅瓊 黃 靜

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發生率呈逐年上升趨勢[1, 2]。早期乳腺癌患者經手術聯合放化療預后較理想，然而晚期乳腺癌患者目前尚缺乏有效治療手段，尋找乳腺癌的早期診斷標志物和分子治療靶點具有重要臨床價值[3]。環狀RNA(circRNA)是一類內源性非編碼RNA，來源于前體信使RNA(mRNA)反向剪接[4]。circRNA的穩定性較高，可通過多種機制影響基因表達，參與調控細胞的生理活動[5]。越來越多的circRNA被發現在腫瘤細胞的生長、轉移中發揮重要作用，影響腫瘤的發生、發展[6]。circRNA已成為乳腺癌分子研究領域的熱點。hsa_circ_0024707是一種新發現的circRNA，尚未被報道研究過，其在乳腺癌細胞中的作用亦不明確。本研究通過檢測hsa_circ_0024707在乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中的表達，并以乳腺癌細胞株為研究對象, 探討hsa_circ_0024707對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響及其作用機制, 為circRNA分子靶向治療研究提供實驗依據。

材料與方法

1.材料：(1)臨床標本：收集2016年3月～2018年7月于筆者醫院行手術切除治療的乳腺癌臨床標本53例，包括乳腺癌組織和距離腫瘤邊緣超過5cm的癌旁組織，術后均經病理醫生確認為乳腺浸潤性導管癌。患者年齡為28～65歲，平均年齡為46.89±8.52歲。組織學分級Ⅱ級18例，Ⅲ級35例，TNM分期T1期5例，T2期29例，T3期19例。患者術前均未行放化療，本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準, 參與患者均簽署知情同意。(2)細胞與試劑：人乳腺癌細胞株SKBR3、BT549、MCF7、MB-MDA-468、HCC1937和永生化乳腺上皮細胞MCF-10A購自中國科學院上海細胞庫；實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購自大連寶生物試劑公司；qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；載有hsa_circ_0024707的慢病毒和空載慢病毒由上海漢恒科技有限公司合成；小牛血清、DMEM/F12培養基、RPMI-1640培養基均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Costar公司；抗體(SPRY2、Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC、α-tubulin)、Matrigel基質膠購自美國BD公司。

2.細胞培養和慢病毒感染：人乳腺癌細胞株MB-MDA-468和永生化乳腺上皮細胞MCF-10A復蘇后，培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，乳腺癌細胞株SKBR3、BT549、MCF7、HCC1937復蘇后，培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，在37℃、5% CO2培養箱中培養。將對數期生長的BT549細胞接種在6孔細胞板，細胞融合度為50%時，選擇感染復數(MOI)=50，根據慢病毒說明書進行操作，采用慢病毒感染BT549細胞。12h后觀察細胞狀態并更換新鮮培養基。

3.實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測：采用Trizol法提取乳腺癌組織和乳腺癌細胞株總RNA，反轉錄合成cDNA后行qPCR檢測。以GAPDH為內參基因，檢測組織或細胞中hsa_circ_0024707和SPRY2 mRNA的相對表達量。以U6為內參基因，檢測細胞中miR-448的相對表達量。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-448上游引物：5′-GGGCAGTGCGTGTCG-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；hsa_circ_0024707上游引物：5′-TGCACAGGGGAAGGAAATAA-3′，下游引物：5′-GATGATGGGGTTGCAAACTT-3′；SPRY2上游引物：5′-CCTACTGTCGTCCCAAGACCT-3′，下游引物：5′-GGGGCTCGTGCAGAAGAAT-3′。qPCR值采用2-ΔΔCt方法進行計算。

4.CCK-8檢測：將感染后的BT549細胞接種于96孔板。CCK-8方法連續檢測5天，繪制細胞生長曲線。檢測時，每孔加5mg/ml的CCK-8試劑10μl，培養箱培養4h，每孔加150μl二甲基亞砜，SpectraMax plus384型全波長酶標儀檢測每孔在波長450nm處的吸光度(A)值。

5.Transwell侵襲實驗：采用Matrigel基質膠制備Transwell小室上室；將感染后的BT549細胞用血清培養基重懸后，接種于Transwell小室上室；下室加入含10%FBS的RPMI-1640培養基；培養24h后，取出上室，多聚甲醛固定10min，0.1%的結晶紫染液染色10min，棉簽拭去上室未穿膜的細胞，PBS溶液漂洗；晾干后，采用倒置顯微鏡計數穿膜細胞數并統計。

6.生物信息學技術預測：starBase v2.0靶基因預測數據庫預測hsa_circ_0024707的下游miRNA，TargetScan Release 3.1靶基因預測數據庫預測miRNA的下游mRNA。

7.蛋白免疫印跡(Western blot)法：將感染后的BT549細胞裂解并提取總蛋白，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉1h。加入一抗SPRY2(1∶1000稀釋)、Wnt(1∶2000稀釋)、β-catenin(1∶500稀釋)、GSK-3β(1∶2000稀釋)、APC(1∶2000稀釋)、α-tubulin(1∶3000稀釋)，4℃孵育過夜，在室溫下二抗孵育2h。ECL顯影液在凝膠成像系統顯影。

結 果

1.hsa_circ_0024707在乳腺癌組織中的表達：qPCR結果顯示，hsa_circ_0024707在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達分別為1.73±0.46和4.53±0.76，hsa_circ_0024707在乳腺癌組織中呈低表達(P<0.05)。

2.hsa_circ_0024707在乳腺癌細胞中的表達：qPCR結果顯示，hsa_circ_0024707在SKBR3、BT549、MCF7、MB-MDA-468、HCC1937細胞株和永生化乳腺上皮細胞MCF-10A中的表達量分別為0.75±0.03、0.12±0.02、0.37±0.02、0.52±0.05、0.39±0.01和1.00±0.05，相比永生化乳腺上皮細胞MCF-10A，hsa_circ_0024707在乳腺癌細胞株中表達下調，差異均有統計學意義(P均<0.01)。hsa_circ_0024707在BT549細胞表達降低最明顯(P<0.01)，故以BT549細胞為對象進行研究，詳見圖1。

圖1 hsa_circ_0024707在永生化乳腺上皮細胞株和乳腺癌細胞株中的表達

3.qPCR檢測感染后BT549細胞中hsa_circ_0024707的表達：qPCR結果顯示，對照組和實驗組乳腺癌BT549細胞中hsa_circ_0024707的表達分別為1.02±0.09和8.05±0.76，差異有統計學意義(P<0.01)，證明外源性hsa_circ_0024707在BT549細胞中成功表達。

4.hsa_circ_0024707對乳腺癌BT549細胞增殖的影響：采用CCK-8法檢測hsa_circ_0024707過表達對 BT549細胞增殖能力的影響，與對照組比較，實驗組BT549細胞從第3天開始，細胞增殖能力明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 hsa_circ_0024707過表達對乳腺癌BT549細胞增殖的影響

5.hsa_circ_0024707對乳腺癌BT549細胞侵襲的影響：采用Transwell侵襲實驗檢測hsa_circ_0024707過表達對 BT549細胞侵襲的影響，對照組和實驗組BT549穿膜細胞數分別為82.46±8.49和38.34±8.84，差異有統計學意義(P<0.05)，證明hsa_circ_0024707過表達能抑制乳腺癌細胞BT549的侵襲，詳見圖3。

圖3 hsa_circ_0024707過表達對乳腺癌BT549細胞侵襲的影響

6.生物信息學預測hsa_circ_0024707的下游基因：starBase v2.0靶基因預測數據庫顯示，hsa_circ_0024707靶基因可能為miR-448。TargetScan Release 3.1靶基因預測數據庫顯示，miR-448靶基因可能為SPRY2，詳見圖4。

圖4 生物信息學預測hsa_circ_0024707的下游基因

7.qPCR檢測感染后BT549細胞中miR-448和SPRY2 mRNA的表達：qPCR結果顯示，對照組和實驗組乳腺癌BT549細胞中miR-448的表達分別為1.00±0.07和0.27±0.05(P<0.01)，證明hsa_circ_0024707過表達可下調BT549細胞中miR-448的表達。對照組和實驗組乳腺癌BT549細胞中SPRY2 mRNA的表達分別為1.01±0.07和5.16±0.30(P<0.01)，證明下調miR-448可上調BT549細胞中SPRY2 mRNA的表達。

8.hsa_circ_0024707過表達對乳腺癌BT549細胞SPRY2蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響：Western blot法結果顯示，與對照組比較，實驗組的 SPRY2蛋白表達上調，而Wnt/β-catenin信號通路蛋白Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC表達下調，詳見圖5。

圖5 hsa_circ_0024707過表達對乳腺癌BT549細胞中SPRY2蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響

討 論

環狀RNA(circRNA)最初被認為是錯誤的剪接副產物，沒有生物學功能[7]。隨著高通量測序技術的發展，大量的circRNA被發現和鑒定，在多種腫瘤中發揮癌基因或者抑癌基因的作用[8]。近年來研究表明，circRNA的異常表達與乳腺癌的發生、發展相關[9]。circRNA如hsa_circ_0001982、circDENND4C、circ-ABCB10、hsa_circ_0008039在乳腺癌組織和細胞株中呈過表達，具有促進乳腺癌的惡性生物性行為的作用，與乳腺癌的不良預后相關[10～13]。circRNA如hsa_circ_0072309、MTO1在乳腺癌組織和細胞株中呈低表達，與乳腺癌的病理分期及預后等相關，具有抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲的作用[8, 9]。hsa_circ_0024707是一個新發現的lncRNA，hsa_circ_0024707在乳腺癌中的表達和作用機制尚不明確。

本研究發現，hsa_circ_0024707在乳腺癌組織和細胞株中呈低表達，提示hsa_circ_0024707可能在乳腺癌中發揮抑癌基因作用。本研究進一步通過CCK-8實驗和Transwell侵襲實驗發現，hsa_circ_0024707過表達可明顯抑制乳腺癌細胞BT549的增殖能力和侵襲能力，進一步提示hsa_circ_0024707在乳腺癌中發揮抑癌基因作用。有研究表明，circRNA含有miRNA反應元件，能通過海綿作用競爭性結合miRNA，下調miRNA的表達，從而調節miRNA下游基因mRNA的翻譯[14]。starBase v2.0靶基因預測數據庫顯示，hsa_circ_0024707靶基因可能為miR-448。TargetScan Release 3.1靶基因預測數據庫顯示，miR-448靶基因可能為SPRY2。miR-448在胃癌、口腔鱗狀細胞癌中表達明顯升高，與患者的不良預后顯著相關，發揮癌基因的作用[15,16]。

SPRY2蛋白由315個氨基酸構成，是一種潛在的抑癌蛋白，在胃癌、卵巢癌、神經膠質瘤等多種腫瘤中低表達，過表達SPRY2可抑制腫瘤的生長和轉移[17，18]。本研究發現，hsa_circ_0024707在乳腺癌細胞BT549中過表達后，miR-448的表達明顯下調，SPRY2基因的表達明顯上調，表明hsa_circ_0024707可能通過下調miR-448的表達，促進SPRY2基因的表達。有研究表明，SPRY2可通過降低β-catenin蛋白的表達，發揮抑制腫瘤的生長和轉移的作用[19]。Western blot法結果顯示，乳腺癌細胞BT549中SPRY2基因表達增加后，Wnt/β-catenin信號通路蛋白如Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC的表達下調，Wnt/β-catenin信號通路的轉導被抑制。

綜上所述，本研究首次驗證hsa_circ_0024707在乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中的表達下調，過表達hsa_circ_0024707可抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，其作用機制可能是hsa_circ_0024707通過下調miR-448的表達，促進SPRY2基因的表達，并抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導。hsa_circ_0024707可能成為乳腺癌治療的分子靶標。