白藜蘆醇激活JNK通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

林曉敏 劉 佳

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是臨床常見(jiàn)且極具危害性的原發(fā)性腦腫瘤。根據(jù)美國(guó)腦腫瘤登記中心2018年發(fā)表數(shù)據(jù)可知，GBM年均發(fā)生率為3.2人/10萬(wàn)人，且為原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者死亡的主要原因之一[1]。目前，手術(shù)是GBM的首選治療方式，但大腦功能的特殊性和GBM的高度侵襲性使腫瘤難以根除。因此，GBM的臨床治療原則是在最大程度上安全切除腫瘤的基礎(chǔ)上輔以不同形式的放療、化療、生物治療或聯(lián)合治療[2]。盡管如此，長(zhǎng)期放、化療使GBM細(xì)胞往往表現(xiàn)出放療抗性和化療耐受性，而腫瘤一旦復(fù)發(fā)患者通常在6個(gè)月內(nèi)離世，因此罹患GBM患者的術(shù)后平均生存時(shí)間仍僅有12～16個(gè)月，雖較未接受治療的患者3個(gè)月生存期稍延長(zhǎng)，但5年生存率依舊低于10%[1, 3]。因此，尋求安全有效的抗GBM新藥或應(yīng)對(duì)TMZ繼發(fā)耐藥的備選藥物，探索其安全可靠性，分析其抗癌的細(xì)胞分子生物學(xué)效應(yīng)，將有助于改善GBM的臨床治療現(xiàn)狀，具有明顯的理論價(jià)值和臨床意義。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學(xué)名稱為3,5,4′-三羥基-1,2-二苯乙烯，是從植物中提取的天然多酚類化合物，已被許多研究證明，具備抗腫瘤、化學(xué)預(yù)防的重要生物活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞體外的啟始、促進(jìn)和發(fā)展[4]。除此之外，白藜蘆醇對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表現(xiàn)出良好的抗癌作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白藜蘆醇處理后的甲狀腺癌和膀胱癌細(xì)胞，電鏡下觀察到線粒體出現(xiàn)腫脹損傷，因此猜測(cè)白藜蘆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)氧化損傷的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，作為MAP激酶家族的一員，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)活化后所激活的JNK通路與氧化應(yīng)激息息相關(guān)，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控[6]。目前，對(duì)于白藜蘆醇、氧化應(yīng)激、JNK這三者之間潛在關(guān)系的研究尚未發(fā)現(xiàn)。本研究對(duì)白藜蘆醇的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6具備很強(qiáng)的抑制作用，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)具備誘導(dǎo)堆積作用，同時(shí)影響JNK通路的活化狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，這為尋找和求證白藜蘆醇的抗腫瘤機(jī)制提供了另一有力的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為評(píng)估白藜蘆醇作為治療膠質(zhì)瘤備選藥物的研究?jī)r(jià)值提供參考。

材料與方法

1.材料：大鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤C6細(xì)胞系受贈(zèng)于上海市第十人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心[7]。C6細(xì)胞在含10%FBS及100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中, 37℃、5.0% CO2條件下培養(yǎng)。每2～3天以1∶4傳代培養(yǎng)。

2.主要試劑：白藜蘆醇購(gòu)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，p-MKK7、c-Jun、Bak多克隆抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司)，JNK、p-JNK單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Bcl-2多克隆抗體(博奧森生物公司)，β-actin單克隆抗體、IgG(美國(guó)Proteintech公司)，噻唑藍(lán)(廣州阜通生物公司)，活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(美國(guó)BD公司)，PrimeScript RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)，PCR檢測(cè)引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

3.MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞, 以1.5×104個(gè)/毫升的密度接種于96孔板, 每孔100μl。實(shí)驗(yàn)組藥物終濃度分別為10、20、30、40、50、100μmol/L,對(duì)照組加入等體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基(0μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔內(nèi)加入10μl MTT工作液，培養(yǎng)箱中孵育4h后，棄去上清，每孔加入100μl DMSO，搖床上振蕩30min以便充分溶解孔底的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，多功能微孔板讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo公司)測(cè)試各孔570nm處的吸光度。

4.凋亡實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6的細(xì)胞, 以105個(gè)/毫升的密度接種于6孔板,每孔1ml, 預(yù)培養(yǎng)24h后, 實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為20μmol/L Res, 對(duì)照組加入等體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基(0μmol/L)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)基連同胰酶消化后的細(xì)胞收集至離心管內(nèi)，離心后冷PBS輕柔洗滌2次，加入1ml binding buffer進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并進(jìn)行適當(dāng)稀釋。取2×104個(gè)細(xì)胞加入200μl Annexin V & PI工作液中，充分混勻后室溫下避光孵育10min，加入800μl binding buffer，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后冰盒中保存，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)選取FITC及PE通道進(jìn)行檢測(cè)。

5.細(xì)胞內(nèi)駐留實(shí)驗(yàn)：取潔凈的玻璃爬片置于12孔板內(nèi)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6的細(xì)胞, 以5×104個(gè)/毫升的密度接種于12孔板, 每孔1ml, 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥，藥物終濃度為100μmol/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。以藥物處理4h為時(shí)間原點(diǎn)，PBS洗滌3次后將細(xì)胞分別使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)0、1、4、24h。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15min，滴加抗熒光淬滅封片液后封片，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)405nm通道激發(fā)，488nm通道接收的條件下進(jìn)行觀察拍攝。

6.ROS檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞, 以105個(gè)/毫升的密度接種于6孔板,每孔1ml, 預(yù)培養(yǎng)24h后, 實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為20μmol/L Res, 對(duì)照組加入等體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基(0μmol/L)培養(yǎng)48h。取2×104個(gè)細(xì)胞加入10μl DCFH-DA，充分混勻后置于培養(yǎng)箱中避光孵育20min。去除培養(yǎng)基，并用冷PBS清洗兩次，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)FITC通道檢測(cè)。

7.Western blot法檢測(cè)：將經(jīng)過(guò)100μmol/L Res處理及對(duì)照組處理后的C6細(xì)胞進(jìn)行裂解和蛋白提取后，各取30μg置于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉液常溫封閉2h后，抗體孵育后(p-MKK7 1∶500, JNK1∶800,p-JNK 1∶500,c-Jun 1∶800, Bak 1∶500, Bcl-2 1∶500, β-actin 1∶10000)，超靈敏多功能成像儀(美國(guó)GE公司)成像。轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF在使用后均用TBST清洗，封閉液封閉2h，并保存于-20℃以待后續(xù)使用。

8.RT-PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)：使用RNA Isolation Kit with Spin Column將經(jīng)過(guò)100μmol/L Res處理及對(duì)照組(0μmol/L)處理后的C6細(xì)胞進(jìn)行RNA提取。嚴(yán)格按照PrimeScript RT reagent Kit說(shuō)明書(shū)對(duì)所提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后使用針對(duì)單個(gè)基因cDNA的引物(表1)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，并置于超靈敏多功能成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行成像。同一處理方法的細(xì)胞β-actin聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物作為定量對(duì)照。

結(jié) 果

1.白藜蘆醇對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制作用：10、20、30、40、50、100μmol/L的Res分別處理C6細(xì)胞48h后，使用MTT進(jìn)行檢測(cè)。從MTT結(jié)果可以看到，隨著Res濃度的升高，細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯降低的現(xiàn)象(圖1A)，各個(gè)濃度的Res對(duì)應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率分別為12.42%±0.46%、33.46%±1.24%、51.56%±2.37%、62.44%±5.79%、71.12%±2.37%、76.65%±0.60%，Res對(duì)C6細(xì)胞的IC50為31.39μmol/L(圖1B)，Res對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用與藥物處理濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

圖1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)C6細(xì)胞增殖的影響

2.白藜蘆醇對(duì)C6細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用：C6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24h后，加入20μmol/L Res繼續(xù)培養(yǎng)24h后，Annexin Ⅴ和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。如圖2所示, 對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)24h后，未見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡情況，而實(shí)驗(yàn)組在20μmol/L Res處理24h后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡比例為22.33%±1.71%(P=0.000)，表明Res可誘導(dǎo)C6細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 白藜蘆醇對(duì)C6細(xì)胞凋亡情況的影響

3.白藜蘆醇在細(xì)胞內(nèi)的駐留部位及駐留時(shí)間：Res在405nm激發(fā)光下可產(chǎn)生綠色熒光并被激光共聚焦顯微鏡捕獲[8]。利用Res這一特性，可通過(guò)激光共聚焦觀察Res在細(xì)胞內(nèi)的駐留時(shí)間。100μmol/L的Res處理C6細(xì)胞4h后，更換完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)0、1、4、24h。在Res處理4h后，整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部均可以觀察到強(qiáng)烈的顆粒感綠色熒光，且細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)了更為強(qiáng)烈的綠色熒光,表明Res可以進(jìn)入細(xì)胞，甚至駐留在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核。撤去Res后，綠色熒光強(qiáng)度驟降，僅在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)微弱的綠色熒光。在24h時(shí)，綠色熒光已幾乎不可見(jiàn)，表明細(xì)胞內(nèi)Res濃度隨著時(shí)間的推移而降低，在24h后，只有少量Res殘留。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察白藜蘆醇在C6細(xì)胞內(nèi)的駐留部位及時(shí)間(×20)

4.白藜蘆醇誘導(dǎo)C6細(xì)胞內(nèi)ROS堆積的作用：ROS是指體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，通常被認(rèn)為是氧代謝的天然副產(chǎn)品，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，ROS累積被認(rèn)為是Res在癌細(xì)胞中引起的生物學(xué)事件之一[5,9]。因此，為了進(jìn)一步明確Res抑制C6細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的機(jī)制,筆者使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了經(jīng)Res處理的C6細(xì)胞中ROS的水平。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在20μmol/L Res處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對(duì)照組顯著增加(P=0.01)，且增加的活性氧水平是對(duì)照組的1.5倍以上(圖4)。

圖4 白藜蘆醇對(duì)C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

5.蛋白水平及基因水平檢測(cè)JNK通路活化狀態(tài)：由于在細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時(shí)，JNK通路可能通過(guò)上調(diào)某些促凋亡基因而發(fā)揮積極作用[10]。因此，可通過(guò)Western blot法和RT-PCR研究了Res誘導(dǎo)ROS積累在JNK通路中以及與JNK相關(guān)基因表達(dá)的潛在影響。在100μmol/L Res處理后，JNK通路上游蛋白，p-MKK7和p-JNK的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P=0.000)。而p-JNK其所調(diào)控的c-Jun，無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平上均呈現(xiàn)出表達(dá)顯著上調(diào)的狀態(tài)(P=0.000)。JNK通路下游蛋白，促凋亡蛋白Bak在100μmol/L Res處理后，表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加(P=0.000)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降了9%(P=0.059，圖5)。

圖5 白藜蘆醇處理后C6細(xì)胞系JNK通路的活化狀態(tài)

討 論

GBM是惡性度極高的原發(fā)性腦腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、根治性切除難度大、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點(diǎn)。因此，即使接受了最大程度的手術(shù)切除，仍需要輔助化療來(lái)降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Res是一種天然的多酚類化合物，對(duì)GBM細(xì)胞有多種抑制作用，但對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)毒性不良反應(yīng)，提示其在GBMs輔助化療中的潛在價(jià)值[11～13]。本研究的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Res對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，且較低濃度的Res(10μmol/L和20μmol/L)對(duì)C6細(xì)胞即有較強(qiáng)的增殖抑制作用，提示C6細(xì)胞對(duì)Res極為敏感，這與Guo等[14]的研究結(jié)果相近。由于白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞大小和形態(tài)影響較大，因此筆者選用較低濃度(20μmol/L)進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，其結(jié)果也進(jìn)一步證明了低濃度的Res(20μmol/L)處理24h即可對(duì)C6細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡作用。

藥物在細(xì)胞內(nèi)的作用部位與其抗腫瘤機(jī)制息息相關(guān)，因此在進(jìn)行機(jī)制研究前，筆者需要明確Res在細(xì)胞內(nèi)的駐留情況。Lan?on等[8]在研究人肝細(xì)胞對(duì)Res的攝取時(shí)發(fā)現(xiàn)，Res可通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和載體介導(dǎo)的方式快速進(jìn)入細(xì)胞，且主要分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核內(nèi)僅核仁可見(jiàn)微弱的綠色熒光信號(hào)。Yuan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Res在乳腺癌細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞核。為了明確白藜蘆醇在細(xì)胞內(nèi)的分布情況及濃度變化，本實(shí)驗(yàn)中筆者使用激光共聚焦顯微鏡，觀察了不同時(shí)間點(diǎn)Res在細(xì)胞內(nèi)的駐留部位及駐留時(shí)間，結(jié)果表明，Res可進(jìn)入細(xì)胞，并同時(shí)駐留在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，且細(xì)胞內(nèi)的Res濃度呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性，即其濃度隨著時(shí)間的推移而降低，且主要位于細(xì)胞質(zhì)。而筆者前期的研究數(shù)據(jù)證明，Res可誘導(dǎo)未分化甲狀腺癌細(xì)胞線粒體內(nèi)過(guò)量ROS堆積，導(dǎo)致其發(fā)生損傷，進(jìn)而發(fā)生凋亡，這與筆者所發(fā)現(xiàn)的白藜蘆醇主要駐留在細(xì)胞質(zhì)相吻合。ROS穩(wěn)態(tài)是正常細(xì)胞和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，在此研究中，ROS特異性染色結(jié)果證實(shí)了在Res治療后，C6細(xì)胞中的ROS顯著增加，加上筆者之前的研究已表明，抗氧化試劑NAC減少活性氧積累，一定程度增加了Res處理后THJ-16T細(xì)胞的存活，因此筆者提出猜想，Res對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體的促氧化劑作用是Res導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的原因[5]。

目前關(guān)于白藜蘆醇抗膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制的研究很多，包括AKT/p53通路、PI3K/Akt/NF-κB通路等等[16,17]。而關(guān)于Res作為促氧化劑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路卻鮮有報(bào)道。進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)作為MAP激酶家族一員的JNK，其在細(xì)胞遭遇氧化應(yīng)激時(shí)發(fā)揮重要作用[18]。因此，筆者對(duì)JNK通路的活化狀態(tài)展開(kāi)研究，以期能探明Res、ROS及JNK通路三者之間的關(guān)系。有研究表明MKK4和MKK7作為JNK上游的兩種MAP激酶家族的成員，可活化JNK，使之成為p-JNK，并發(fā)生胞質(zhì)向胞核的易位[19]。為了保證有足量的JNK通路相關(guān)蛋白和RNA，筆者選用了高濃度Res(100μmol/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Res處理后，p-MKK7和p-JNK蛋白量顯著增加，提示Res確實(shí)可激活JNK。進(jìn)一步參考相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子c-Jun是JNK最常見(jiàn)的靶向基因之一，而活化的c-Jun可激活下游某些促凋亡蛋白如Bak，而與Bak相關(guān)的抗凋亡蛋白Bcl-2亦可被活化的JNK所抑制[19]。而筆者對(duì)下游蛋白的研究結(jié)果，c-Jun、Bak表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)減少，恰好證實(shí)了這一過(guò)程。整合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者提出關(guān)于Res、ROS及JNK通路之間關(guān)系的猜想，即Res可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ROS堆積使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活JNK通路，引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，但駐留時(shí)間很短。較低濃度的白藜蘆醇即對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6有較強(qiáng)的增殖抑制和促凋亡作用，并首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過(guò)誘導(dǎo)C6細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，激活JNK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，對(duì)于白藜蘆醇的抗腫瘤機(jī)制的研究，仍有待于進(jìn)一步完善。后續(xù)可加設(shè)抗氧化劑NAC組以及氧化劑H2O2組，觀察C6細(xì)胞增殖情況、凋亡情況的變化等，或者沉默JNK，觀察Res處理后C6細(xì)胞的凋亡情況以及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)情況，以更充分地論證Res對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的促氧化作用誘導(dǎo)JNK通路激活，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。