紅細胞抗氧化機制的研究進展

楊 蕾 凌 玲 郁多男

氧化應激是德國科學家Sies H在1985年首次提出的生理概念，指的是機體在受到內外環境有害刺激時，細胞中氧化物與抗氧物的平衡被打破所引起的細胞和組織損傷[1]。ROS在一定程度上是必需的，可以幫助機體消滅細菌，清除體內毒素，但是當其產生過多時，不能被抗氧化酶及時清除，就成了危害人體健康的一大危險因素。氧化應激理論一經提出，研究者們對抗氧化的研究便緊緊相隨。

一、研究背景

1.紅細胞的特殊結構：成熟紅細胞(red blood cells，RBCs)形如雙凹圓盤，是血液中數量最多的一種血細胞，游走于全身組織器官并發揮氣體交換、氧化還原、腫瘤免疫等重要生理功能。在這一過程中，RBCs不斷遭到ROS攻擊，導致其漸進損傷和最終衰老，主要原因是RBCs結構的一些特殊性：①紅細胞膜脂質富含不飽和脂肪酸，而多不飽和脂肪酸含有雙鍵，持續暴露于高氧水平極易被過氧化[2]；②紅細胞總蛋白的95%為富含Fe2+的血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，鐵是自由基反應的催化劑；③正常生理情況下，線粒體可以通過多種機制來消除ROS，但成熟紅細胞無線粒體等細胞器，所以損傷后很難自我修復。

2.紅細胞氧化損傷的機制:研究表明，在多種生理病理條件下紅細胞都易發生氧化損傷，降低血液供氧能力，加重組織缺氧從而影響機體的運動能力和恢復過程[3]。紅細胞發生氧化損傷后ROS會攻擊紅細胞胞內的主要成分——Hb，Hb被氧化成高鐵血紅蛋白(methehemoglobin，MetHb)而不能再與氧氣結合向組織供氧，當體內MetHb含量達到一定濃度時會導致機體昏迷甚至死亡[4]。微循環是進行氣體和物質交換的重要場所，紅細胞必須形變才可以穿過比自己直徑小的毛細血管到達周圍組織發揮供氧功能，維持微循環的有效灌注[5]。這一過程主要依賴于膜的完整性和變形性。氧化應激時Hb氧化會使蛋白交聯聚合或形成二硫鍵，沉積在細胞膜內側，影響骨架蛋白延展性。ROS還會攻擊紅細胞膜脂質，生成脂質過氧化物(lipid peroxide，LPO)，如氧化應激的標志物丙二醛，使膜蛋白和磷脂交聯，直接破壞質膜的磷脂雙分子層結構和膜骨架蛋白，紅細胞發生異形改變，導致細胞膜失去良好的流動性，脆性增加，變形能力下降[6]。這也使得紅細胞聚集，血液黏度升高，血管阻力增大，細胞壽命縮短，免疫黏附功能障礙，與許多自身免疫疾病和心腦血管疾病如高血壓、冠心病等的發生、發展及不良預后密切相關[7]。這些都表明了紅細胞抗氧化應激機制的研究與維持機體健康密不可分。

二、硫氧還蛋白過氧化物酶-2的抗氧化作用

紅細胞運輸氧氣導致其不斷接觸內源和外源性ROS而產生氧化應激。為了盡量減少ROS對細胞的損傷以及由此產生的應激影響，RBCs具有廣泛的非酶抗氧化系統(如谷胱甘肽和維生素E)和抗氧化酶系統[8]?？寡趸赶到y包括：①超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，SOD專門清除超氧陰離子自由基；②過氧化氫酶(catalase，CAT),CAT能通過催化過氧化氫的分解來發揮抗氧化作用；③谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx),GPx可以清除過氧化氫和脂質過氧化物。

硫氧還蛋白過氧化物酶-2(peroxiredoxin-2，Prx2)是最近發現的抗氧化防御酶家族成員，也是紅細胞中第3豐富的蛋白質，利用半胱氨酸殘基分解過氧化物，能有效地清除低水平的H2O2。Nagababu等[9]建立的Prx2敲除小鼠模型表現為輕度慢性溶血性貧血，Hb持續自氧化會伴隨產生超氧化物，這是一種相對不活躍的自由基，SOD迅速將之歧化為H2O2，Prx2和GPx再進一步分解為水和氧氣，降低Hb的自氧化作用，減輕ROS誘導的Hb聚集(圖1)。Rocha等[8]也指出Prx2和GPx負責清除細胞內源性/低濃度的H2O2，平均MetHb水平和血紅蛋白降解顯著增加，降低了紅細胞變形能力。MetHb可以看作紅細胞氧化應激的間接指標，因為它的升高意味著MetHb的還原水平難以跟上Hb的自氧化。

圖1 氧化應激時血紅蛋白的氧化還原

在紅細胞抗氧化酶中，Prx2是唯一一種至少部分與膜相關的酶。在正常條件下，約5%的Prx2通過C-末端綁定膜帶3蛋白與膜結合，被證明可以清除脂質氫過氧化物，防止血紅蛋白降解產物的形成以及所伴隨的鐵的釋放，抑制紅細胞變形能力受損和酶活性的下降[8，10]?？紤]到紅細胞中Prx2的高濃度，5%是不容忽視的。還有進一步的研究表明，Prx2與膜的結合程度受氧化應激和缺氧的影響，Prx2是在缺氧條件下與膜結合Hb自氧化產生的H2O2反應的首選酶，可以抑制細胞骨架蛋白質損傷所導致的紅細胞膜形態改變[11]。

三、miR-144/451與紅系氧化應激

紅細胞系由不同發育階段的紅細胞組成，從原始紅細胞分化脫核最終變為成熟紅細胞。研究發現，這一發育過程受到一個龐大且精密的系統調控。microRNA(miRNA)是一類長度為18～25核苷酸(nt)的非編碼小分子RNA，通常降低靶基因轉錄本的穩定性或抑制靶基因轉錄本的表達[12]。miR-144/451在人和小鼠基因組中分別位于17號和11號染色體上，是一個雙順反子基因位點，編碼兩個高度保守的miRNAs：miR-144-3p和miR-451a。miR-144/451在紅細胞內表達很豐富，且幾乎完全存在于紅細胞中[13,14]。主要有以下轉錄因子參與miR-144/451紅系氧化應激過程。

1.FOXO3a(forkhead box O3a)：FOXO3a作為紅系中一個重要的核轉錄因子，在氧化應激的多個信號通路中發揮重要作用，通過轉錄調控一些凋亡/細胞生長相關基因在凋亡和細胞生長中起著關鍵作用[15]。FOXO家族的成員具有一個獨特的高度保守的叉頭DNA結構域，該結構域受蛋白激酶Akt、SGK和IKKβ負調控。這些激酶對FOXO3a的磷酸化作用導致FOXO3a從細胞核移送到細胞質，轉錄活性被抑制。最近的研究也揭示了FOXO在保持造血干細胞自我更新能力方面的重要性，FOXO3a在應對生理氧化應激中起重要作用，從而調解在HSC隔間中靜默和增強存活率，這是其長期再生潛力所必需的功能[16]。小鼠miR-144/451基因被敲除后，紅細胞氧化應激的敏感度顯著增加，這主要由于miR-451靶基因Ywhaz的表達明顯增高所致。ROS水平增高又使得AKT急劇磷酸化，磷酸化后的FOXO3a暴露結合位點與Ywhaz所編碼的14-3-3ζ蛋白形成復合物，從細胞核內轉移到細胞核外，并且14-3-3ζ蛋白封閉核定位信號，阻止FOXO3a再入核，降低FOXO3a轉錄抗氧化酶的功能，導致紅細胞中CAT和GPx-1生成減少，紅細胞氧化應激損傷加劇，貧血加重[17]。

2.NF-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)：Nrf2是調控細胞氧化應激反應的另一個重要轉錄因子，維持細胞內氧化還原穩態[18]。氧化應激發生后，原被Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(kelch-like ECH2 associated protein 1，Keap1)蛋白錨定在細胞骨架上的Nrf2，與Keap1解離進入細胞核，并與抗氧化反應元件結合，啟動下游靶基因抗氧化酶的表達，可以減輕ROS和親電體引發的細胞損傷，從而抑制氧化應激反應[18]。miR-144和Nrf2信號之間的潛在聯系已在許多細胞和組織類型中進行了探索[19～21]。miR-144通過堿基互補原則結合Nrf2的3′非翻譯區(3′-untranslated region，3′UTR)，抑制Nrf2的mRNA翻譯。由此可見，miR-144和miR-451共同參與紅細胞的抗氧化作用。

四、丙酮酸鈉的抗氧化機制

丙酮酸鈉的抗氧化、抗炎及細胞器官保護作用已經在多個模型中得到驗證，也可以改善紅細胞功能，減輕紅細胞氧化損傷。目前認為主要通過以下幾種途徑：(1)作為簡單的α-酮酸，能夠中和H2O2的氧化能力，與H2O2反應生成二氧化碳和水，阻止H2O2濃度升高殺傷正常細胞，抑制ROS的生成[22]。(2)紅細胞因為胞內沒有線粒體，主要從血漿中攝取葡萄糖，90%～95%經糖酵解途徑代謝。當細胞發生氧化損傷時，糖酵解途徑中的關鍵酶，即磷酸果糖激酶1會失活，使糖酵解途徑受阻。而丙酮酸是糖代謝途徑中的關鍵中間產物，在糖酵解途徑中，內源性丙酮酸可經由乳酸脫氫酶(LDH)催化轉化為乳酸供能，同時促進NAD+(氧化型輔酶Ⅰ)向NADH(還原型輔酶Ⅰ)轉化。NADH可以抑制脂質過氧化反應，作為輔助因子在NADH脫氫酶作用下還原MetHb(圖1)。已有研究證明外源性丙酮酸鈉同樣可以阻止糖酵解障礙，保持NAD+/NADH的正常比例[23]。(3)丙酮酸鈉升高GSH/GSSG比率從而發揮抗氧化作用。磷酸戊糖途徑中，丙酮酸鈉促進NADPH(還原型輔酶Ⅱ)的生成，NADPH是細胞內很重要的還原當量，最關鍵的一個作用是把氧化型谷胱甘肽(GSSG)重新還原成谷胱甘肽(GSH)，而GSH是細胞內重要的自由基清除劑，可以保護膜蛋白和血紅蛋白中巰基不被破壞，維持紅細胞活性。

上述有關丙酮酸鈉抗氧化作用的研究在臨床上很有指導意義。例如，輸血是外科治療中挽救患者生命的重要手段之一，但紅細胞存儲效果的維持也是一大難點。有研究發現,在紅細胞儲存過程中，添加外源性丙酮酸鈉，可以使儲存血細胞的能量代謝水平提高而降低氧化應激水平，從而改善紅細胞存儲損傷問題，減小回輸體內后不良反應的發生率[24]。

五、展 望

氧化應激的概念提出以來，研究者在氧化應激/抗氧化平衡等方面做了很多探索，外源性的熱輻射、環境污染、氧化還原類的物質等都能使細胞產生ROS，人們尋求抗氧化劑來清除自由基以制止氧化應激對身體的傷害。紅細胞的重要生理作用和特殊結構特點使其更易受氧化應激損傷。紅細胞的損傷影響著與人類健康息息相關的多種血液疾病，但目前針對紅細胞體系的相關研究還不是很多，所以進一步科學全面的研究紅細胞抗氧化機制來預防血液疾病或改善健康是非常有必要的。希望未來能通過干預紅細胞氧化損傷后發生的血紅蛋白變性、膜脂質和膜蛋白被破壞、酶活性降低、糖酵解受阻等中間環節，盡可能維持紅細胞正常生理形態和功能狀態。