Fam114A1蛋白對黑素細胞生物學功能影響的初步研究

周妙妮 林福全 吳辛剛 許愛娥

杭州市第三人民醫院皮膚科310009

Fam114A1（family with sequence similarity 114 member A1）基因編碼的蛋白屬于Fam114 家族，又名為Noxp20，在神經細胞的發育中起重要作用［1］。Fam114A1 蛋白廣泛分布于機體組織，包括皮膚組織，其基因突變與強直性脊柱炎及自身免疫性腸炎的發病有一定相關性［2］，但均為基因水平的相關研究，在不同組織、細胞中生物學功能的研究目前尚未見報道。黑素細胞屬于神經嵴來源的細胞，與神經細胞有一定的生物學共性，黑素細胞發育及功能異常會引起一系列色素性疾病，如泛發性色素異常癥［3］、斑駁?。?］等。Fam114A1是否參與黑素細胞的發育以及功能調控，國內外尚未見報道。本文從多方面研究Fam114A1 基因對黑素瘤細胞A375 生物學功能的影響，初步探討其對黑素細胞生物學功能可能的調控作用。

材料與方法

1.主要試劑和材料：A375細胞（天津賽爾生物技術有限公司）；胰蛋白酶、DMEM 培養基、Opti?MEM 培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP?1）、前黑素小體蛋白（PMEL）、小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、多巴色素異構酶（DCT）、Fam114A1 抗體（美國BD 公司），MTT 細胞增殖檢測試劑盒（美國Ameresco 公司），Transwell小室（美國Milipore公司）。

2. 建立穩定過表達和抑制Fam114A1 蛋白的A375 細胞株：構建Fam114A1 過表達質粒pSR?CMV?GFP/Fam114A1 和抑制質粒pRNT?U6.2?lenti?Fam114A1，并包被慢病毒，分別作為過表達組和表達抑制組，以轉染空載慢病毒的A375 細胞作為對照組。慢病毒感染前1天接種2×105A375細胞于24 孔板，每孔細胞融合達60%～80%時，將病毒液（感染復數MOI=20）加入含8 μg/ml溴化己二甲銨的DMEM培養基24 h，之后更換為不含溴化己二甲銨的DMEM完全培養基。繼續培養48 h，通過熒光顯微鏡觀察慢病毒轉染效率［綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞/總細胞數］，然后裂解細胞檢測Fam114a1蛋白表達量，驗證過表達和抑制Fam114a1 蛋白的效果。再將對照組、過表達組和表達抑制組A375細胞分別稀釋為1 000個/ml的單細胞懸液，用有限稀釋法篩選獲得能穩定過表達或抑制Fam114a1蛋白的A375單克隆細胞。單克隆細胞在完全培養基中繼續培養，獲得單克隆細胞系。

3.實時熒光定量PCR 檢測黑素合成相關基因TYR、TYRP?1、PMEL、MITF、DCT mRNA 的表達：Trizol 法提取各組細胞總RNA。2 μg 總RNA 反轉錄成cDNA，再行熒光定量PCR 檢測。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計和合成，引物序列見表1。反應體系20 μl，反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共30 個循環。以GAPDH 為內參，結果采用2-△△Ct表示，△Ct = Ct目的基因－Ct內參基因，△△Ct =△Ct過表達組或表達抑制組－△Ct對照組，每個樣本重復3次，取平均值。

正向引物序列TGAAGGTCGGAGTCAACGGA GCAAAGCATACCATCAGCTCA TCTCTGGGCTGTATCTTCTTCC AGGTGCCTTTCTCCGTGAG CTCACAGCGTGTATTTTTCCCA AACTGCGAGCGGAAGAAACC反向引物序列CCTGGAAGATGGTGATGGGAT GCAGTGCATCCATTGACACAT GTCTGGGCAACACATACCACT AGCTTCAGCCAGATAGCCACT ACTTTCGGATATAGTCCACGGAT CGTAGTCGGGGTGTACTCTCT基因GAPDH TYR TYRP1 PMEL MITF DCT

4.Western 印跡法檢測Fam114A1 及黑素合成相關蛋白的表達：提取各組細胞總蛋白，用含β 巰基乙醇5×上樣緩沖液煮沸變性。取適量蛋白樣品進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜。室溫搖動封閉2 h，加入1∶1 000 TBST 緩沖液稀釋的GAPDH、TYR、MITF、Fam114A1 抗體，4 ℃過夜。1×TBST 溶液洗膜4次，加入緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 二抗，室溫作用1.5 h。1×TBST溶液洗膜4次，顯色劑作用30 s后，暗室中曝光、顯影和定影處理。用LabWorksTM凝膠成像及分析系統拍攝膠片，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

5.MTT 法檢測A375 細胞增殖活性：將各組對數生長期細胞接種于96孔板，每組5孔，2 000個細胞/孔，48 h 后每孔加入10 g/L MTT 溶液10 μl。4 h后棄去原培養基，加入100 ml DMSO，搖床振蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀490 nm 波長處測量各孔A值（代表細胞增殖活性）。

6. 細胞遷移實驗檢測A375 細胞遷移能力：Transwell 小室底面涂0.5 g/L 纖維連接蛋白10 μl，超凈臺內風干備用。取105個細胞置于1.5 ml EP管中，200×g 離心5 min，去上清液，加入200 μl 無胎牛血清的DMEM 培養基重懸細胞，加入小室中。下層小室加入含20%胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后取出小室，徹底去除小室內層細胞。小室外層細胞用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定30 min，結晶紫染色15 min。清洗干凈并將膜固定于載玻片上，顯微鏡下選取3 個隨機100 倍視野拍照并計數細胞，取平均值作為遷移的細胞數。

7. 細胞黏附實驗檢測A375 細胞黏附能力：0.2 g/L matrigel 膠包被96 孔板3 h，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）輕洗2 遍，每孔加入0.5%牛血清白蛋白100 μl，置37 ℃孵箱中封閉2 h，1 × PBS 輕洗2 遍備用。用胰酶消化細胞，調整細胞密度為2.5 ×104/100 μl，將細胞懸液滴加至96 孔板中，每組設3 個復孔，置37 ℃孵箱中繼續培養，90 min 后去除培養基和懸浮細胞，MTT 法測定490 nm 處A 值（代表細胞黏附能力）。

8.統計學分析：采用SPSS 23.0軟件分析數據，計量資料采用±s表示，多組的比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett?t檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

結果

1.穩定過表達和抑制Fam114A1 的A375 細胞株的建立：熒光顯微鏡觀察慢病毒轉染效率，對照組、過表達組和表達抑制組的轉染效率均在90%左右，見圖1A。Western 印跡結果顯示，3 組A375 細胞中Fam114A1 蛋白相對表達差異有統計學意義（F=50.088，P=0.000 2），過表達組（1.507±0.170）顯著高于對照組（0.850 ± 0.120，t = 5.888，P =0.001），表達抑制組（0.397 ± 0.120）顯著低于對照組（t = 4.065，P = 0.007），見圖1B。進一步篩選單克隆細胞，成功獲得Fam114A1 穩定過表達和抑制的單克隆細胞株。

2. Fam114A1 對A375 細胞黑素合成相關基因mRNA 及蛋白表達的影響（圖2）：實時熒光定量PCR 結果顯示，3 組間TYR 和MITF mRNA 相對表達差異有統計學意義（F = 43.052、39.460，P =0.000 3、0.000 4），而TYRP?1、PMEL、DCT mRNA 相對表達差異無統計學意義（F=3.005、2.535、0.886，P = 0.125、0.159、0.460）。表達抑制組TYR 和MITF mRNA 相對表達顯著低于對照組（t=7.014、6.672，P<0.001、=0.001），而過表達組與對照組相比，差異無統計學意義（t=0.164、1.843，P=0.140、0.112）。見圖2A。

Western 印跡結果顯示，3 組間TYR 和MITF 蛋白表達差異有統計學意義（F=22.750、13.389，P=0.002、0.006），其中，表達抑制組顯著低于對照組（t=4.421、4.269，P=0.004、0.005），而過表達組與對照組相比差異無統計學意義（t = 2.243、0.581，P=0.069、0.584）。見圖2B、2C。

3. Fam114A1 對A375 細胞增殖活性的影響：MTT 法顯示，培養48 h 后表達抑制組A375 細胞增殖活性顯著高于對照組（t=3.812，P=0.009），但過表達組與對照組差異無統計學意義（t=0.541，P=0.572）。見表2。

4. Fam114A1 對A375 細胞遷移能力的影響：Transwell小室遷移實驗顯示，過表達組遷移細胞數量顯著多于對照組，差異有統計學意義（t=3.110，P=0.021），而表達抑制組明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=4.242，P=0.005）。見圖3、表2。

5. Fam114A1 對A375 細胞黏附能力的影響：MTT 法顯示，表達抑制組細胞黏附能力高于對照組，差異有統計學意義（t=6.373，P=0.001），而過表達組與對照組相比差異無統計學意義（t=0.814，P=0.504）。見表2。

討論

Fam114A1 基因位于人類第4 號染色體，包含14 個外顯子，編碼的蛋白主要在細胞質中表達。研究［1］顯示，Fam114A1蛋白在小鼠大腦、脊髓等神經系統中高表達，并在小鼠胚胎發育的不同階段差異表達，提示Fam114A1 可能與神經細胞的發育密切相關。黑素細胞與神經細胞共同起源于胚胎外胚層的神經嵴，而毛囊隆突區的神經嵴干細胞除了可以分化為神經元和神經膠質細胞，還可分化為黑素細胞［5］。Fam114A1是否參與黑素細胞的發育及功能調控，國內外尚未見報道。

細胞增殖活性（A值）0.706±0.035 0.917±0.110a 0.738±0.026 8.904 0.016遷移細胞數（個）267.000±30.200 185.700±11.400a 326.700±24.700b 27.313 0.001組別對照組表達抑制組過表達組F值P值細胞黏附能力（A值）0.524±0.035 0.733±0.045a 0.545±0.026 22.670 0.002

為研究Fam114A1 對黑素細胞生物學功能的影響，我們構建了穩定過表達及抑制Fam114A1 的A375單克隆細胞株。進一步細胞生物學功能研究顯示，抑制Fam114A1表達可顯著下調A375細胞中黑素合成相關蛋白TYR 和MITF 的表達。TYR 和MITF 是調控黑素合成的關鍵基因。MITF 可調節神經嵴細胞的定向分化和細胞周期進展，參與黑素細胞增殖及黑素化，調控色素合成限速酶相關基因TYR、TYRP?1 等表達，是黑素細胞生長存活、黑素生成的主要調節者［6］。MITF 和TYR 表達的下降，會引起黑素細胞黑素合成功能下降，使黑素合成減少，造成皮膚色素脫失［7］。本研究結果顯示，Fam114A1可影響A375細胞中TYR和MITF蛋白的表達，提示其可能影響黑素細胞的生物學功能，參與調控黑素合成。

此外，我們還發現，Fam114A1蛋白表達的抑制可一定程度刺激A375 細胞的生長，增強其黏附能力，降低其遷移能力。當Fam114A1 蛋白過表達時，A375細胞的遷移能力顯著增強，但對細胞生長和黏附能力無顯著影響，這可能與A375 細胞本身的高增殖率和黏附能力有關。因此，有必要進一步用正常的黑素細胞驗證Fam114A1 蛋白對其生長、黏附方面的影響。

綜上所述，Fam114A1 蛋白對黑素瘤細胞系A375 的生物學功能有多方面的影響，如黑素合成和遷移能力，Fam114A1 可能是一種參與調控黑素細胞生物學活性的功能蛋白。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突