卵泡顆粒細胞預測妊娠相關生物標志物研究進展

蔣雨薇,張梓卉,曾銘華,黨小紅,劉習明,張 妍

(長沙生殖醫學醫院，湖南 長沙 410205)

卵泡細胞反映了卵母細胞的整體健康狀況以及胚胎的后續發育能力。顆粒細胞與單個卵母細胞相關的生物標志物可用于輔助生殖預測何種胚胎最有可能植入子宮并完成妊娠。本綜述中，我們對近年來涉及胚胎發育和妊娠有關的人卵泡顆粒細胞生物標志物進行了匯總，對其微陣列數據和定量RT-PCR驗證表達基因的研究進行了評估，提示顆粒細胞生物標記物有助于識別成熟卵母細胞以期提高妊娠和活產率。

在過去三十年中我國輔助生殖技術雖然有所改進，但不孕患者妊娠率和活產率仍不理想。對于未來的發展，提高胚胎選擇及植入率是提高生育治療效率的關鍵。使用激素療法來誘導排卵以及其他用于生產胚胎的技術包括IVF、ICSI、IMSI及捐贈卵子等改進的空間不大。缺乏客觀、準確和無創的胚胎評估策略仍然是體外受精面臨的主要挑戰之一。隨著胚胎發展實時檢測技術及PGD/PGS技術的出現，胚胎選擇成為生育治療最有發展前景的領域。顆粒細胞反映了卵母細胞的特性，為評估卵母細胞質量提供了一種無創手段。近年來，應用qRT-PCR和微陣列技術，一些研究將顆粒細胞基因表達的變化與胚胎發育和妊娠結局聯系起來。本綜述主要評估卵泡顆粒細胞的生物標志物來預測選擇胚胎以期提高體外受精妊娠的成功率。

1 顆粒細胞生物標志物篩選

卵母細胞和顆粒細胞之間縫隙連接和旁分泌通訊的相互作用系統為卵母細胞的發育、排卵、受精和隨后的植入創造了最佳條件。目前的研究擬用顆粒細胞的基因表達譜識別產生高質量胚胎的卵母細胞，以非侵入性的方式準確地反映卵母細胞的生育潛能。顆粒細胞基因標志物的研究選擇有不同端點，包括卵母細胞核成熟期、受精期、第2～3天胚胎期、第5～6天囊胚期、著床期、妊娠和活產期，并根據妊娠結局確定胚胎質量和能力。迄今發表的研究表明，qRT-PCR作為一種敏感和有效的方法，廣泛應用于單個轉錄樣本的定量。另一方面，利用微陣列技術進行全基因組表達譜分析，為研究人員開辟了一個新的視角，有望鑒定出可行胚胎的轉錄標志。

2 顆粒細胞標記物與卵母細胞胚胎發育相關的微陣列及qRT-PCR分析

卵母細胞的發育能力是其恢復成熟、成功受精和達到囊胚期的能力。這種能力是通過與卵泡的體細胞相互作用而獲得的。卵丘和顆粒細胞支持卵母細胞的發育，而卵母細胞則影響卵泡細胞的生長和分化。研究表明，卵泡刺激素和黃體生成素通過蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)在顆粒細胞中啟動信號，在卵母細胞能力獲得中起重要作用。Tremblay PG等采用基因芯片和RT-qPCR技術，觀察PKA和PKC刺激對顆粒細胞瘤基因表達的影響[1]。蛋白激酶驅動的信號涉及五個主要的上游調節，即表皮生長因子(EGF)[2]，轉化生長因子β1(TGFβ1)[3]、血管內皮生長因子(VEGF)[4]，堿性成纖維細胞生長因子(FGF 2)[5]和肝細胞生長因子(HGF)[6]。與7種主要卵巢功能相關的基因有：炎性反應[7-8]包括前列腺素內切酶2(PTGS2)，白細胞介素8(IL-8)和白細胞介素6(IL-6)；類固醇生成[9-11]包括立體致敏的急性調節蛋白(STAR)、細胞色素P450家族11亞家族A成員1(CYP11A1)，以及細胞色素P450家族19亞家族A成員1(CYP19A1)；血管生成[12-14]包括血管內皮生長因子C(VEGFC)、血管內皮生長因子A(VEGFA)和血管生成C-X-C趨化因子受體四型(CXCR 4)；分化[15-16]包括表皮生長因子(AREG)，表皮生長因子受體(EGFR)和RTK信號拮抗劑2(SPRY 2)；細胞凋亡[17-19]包括BCL 2相關聯X(bax)，bcl-樣蛋白12(Bcl2L12)和半胱天冬酶1(CASP 1)；基質[20-21]包括細胞周期蛋白D1(CCND 1)，細胞周期蛋白B1(CCNB 1)，細胞周期蛋白B2(CCNB 2)；排卵[22-23]包括金屬蛋白酶1(MMP1)、金屬肽酶9(MMP 9)和TIMP金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP 1)。

在研究顆粒細胞基因表達與體外胚胎發育的關系的研究中，McKenzie等人評估了在108個人卵泡顆粒細胞中與卵母細胞成熟、受精和胚胎質量相關的HAS2、PTGS2和GREM1[24-27]。結果發現，PTGS2和HAS2在發育為高級別胚胎的卵母細胞周圍的顆粒細胞中的表達增加了6倍，GREM1的表達增加了15倍。應用qrt-PCR技術，對單個卵母細胞的顆粒細胞進行了檢測，發現顆粒細胞在卵母細胞中顯著表達PTGS2。van Montfoort等人進行了基因芯片實驗，比較了8個卵子早期卵裂胚胎和8個非早期卵裂胚胎卵母細胞中的基因表達[28]，結果顯示，共有611個基因有差異表達，這些基因參與了許多生物學過程，包括細胞周期、血管生成和凋亡等。在已鑒定的基因中，細胞周期蛋白D2(CCND 2)[29]、趨化因子受體4(CXCR 4)[14]、谷胱甘肽過氧化物酶3(GPX 3)[30]、鈣黏素相關蛋白1(CTNND 1)[31]、7-脫氫膽固醇還原酶(DHCR 7)[32]、紊亂節段極性蛋白3(DVL 3)[33]、熱休克27 kDa蛋白1(HSBP 1)[34]和三重基序28(TRIM 28)[35]是qrt-PCR分析證實的最重要的基因。這些基因表達的改變被認為是非早期卵裂胚胎缺氧狀態或卵母細胞成熟延遲的標志。隨后，Assou等人提出了一種基于微陣列基因表達譜的比較[36]，從而獲得了630個差異表達基因研究的鑒定結果。經qRT-PCR證實bcl-樣蛋白11(BCL2L11)[37]和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK 1)[38]表達上調，核因子IB(NFIB)[39]表達下調。這些基因有較高的表達水平，提示顆粒細胞的轉錄激活對胚胎的發育能力至關重要。以上結果表明顆粒細胞的轉錄組分析有助于識別卵母細胞發育狀態，可能作為新的無創標記而替代入侵診斷試驗的方法。

3 顆粒細胞標記物與妊娠能力相關的微陣列及qRT-PCR分析

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，應考慮基因表達分析，以確定可能導致妊娠的卵母細胞[40]。Hamel等人的三項連續研究報告了妊娠結局與顆粒細胞轉錄體之間的關系[41-43]。在其研究中，使用cDNA微陣列和基因芯片，對顆粒細胞的基因表達進行了分析。從代表孕婦和非孕婦患者的集合樣本中提取的消減文庫中提取定制微陣列包含顆粒細胞表達的序列標簽(EST)。在115個差異表達基因中，3-β-羥色胺脫氫酶(HSD 3β1)[44]的表達發生了改變，鐵氧還蛋白1(FDX 1)[45]，絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑類成員2(SERPINE2)[46]、細胞色素P450芳香化酶(CYP19A1)[11]和細胞分裂周期42(CDC42)[47]與妊娠結局顯著相關。利用這項初步研究的結果，研究人員隨后確定了磷酸甘油酸激酶1(PGK 1)[48]、G蛋白信號調節因子(RGS 2、RGS 3)[49-50], CDC42和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP 2)[51]以及血小板-白細胞C激酶底物同源結構域A族成員1(PHLDA 1)[52]，作為與胚胎質量相關致妊娠成功的潛在標記。

綜上所述，與卵母細胞相關的顆粒細胞是鑒定生物標志物的有價值的來源，從而可靠地選擇能夠導致活產的胚胎。在評估顆粒細胞轉錄學的研究中所發表的結果顯示，對顆粒細胞作為卵母細胞胚胎發育和質量標記物的共識是有限的。這可能是由于實驗室環境、研究結果指標、研究群體的規模和利用技術的變化造成的。此外，在評估卵泡顆粒細胞有關胚胎質量和其他生殖終點的微陣列和qRT-PCR數據時，主要的困難之一是患者群體的異質性。影響體外受精結局和基因表達的患者特征包括年齡、體重指數(BMI)、診斷、刺激類型、刺激過程中的激素水平和卵母細胞產量等，因此選擇患者是鑒別顆粒細胞預測妊娠的生物標記物的關鍵。由于IVF患者在尋找潛在的生物標志物時要考慮許多不同的特點，逐步多因素分析可能是選擇子宮移植胚胎最有希望的方法。雖然許多研究都集中在授精成熟卵母細胞的結果上，但在子宮移植時并不能保證被評估的胚胎在基因上是正常的。顆粒細胞轉錄與植入前遺傳篩查PGS的結合可能是改善子宮移植胚胎選擇的下一步，因為這將認可胚胎倍性狀態及基因表達生物標志物與活產的關系。顆粒細胞生物標志物也可能有更多的應用，鑒于許多成熟卵母細胞在形態上相似，顆粒細胞生物標記物有助于識別成熟卵母細胞。在將來，顆粒生物標志物可能會在卵母細胞受精之前進行評估，只選擇那些能夠導致活產的卵母細胞去受精，以期提高妊娠和活產率。