發酵溫度對蘋果酵素抗氧化性和安全性的影響

李 紅，毛繼龍，陳文靜，邱忠平，李 萍，彭傳海，李明星，湯國雄

（西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都 610031）

酵素是以水果、蔬菜、食用中藥材等為原料，通過微生物發酵而成的一類具有保健功能的發酵制品[1]。酵素中不僅含大量氨基酸等發酵原料中的原有成分，也有較高含量的還原糖、維生素C、酚類、花色苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化物質[2]，具有抗氧化、清除人體自由基等多種益生作用[3-4]。蘋果富含維生素C、酚類、礦物質等多種功效物質，是人體外源性抗氧化物質的重要來源之一[3]。蘋果是酵素良好的原料，蘋果酵素不僅保留了蘋果中原有的有效成分，發酵過程中還會產生多種生物活性物質及功效酶，可降解食物中蛋白質等物質，利于人體吸收，同時還有助于清除人體代謝中凋亡的細胞[5]，具有很高的實用價值。

發酵溫度通過影響微生物生長代謝，進而影響酵素中抗氧化物質含量和抗氧化活性，是決定酵素品質的重要因素之一。研究表明，適宜的發酵溫度是生產高品質酵素的關鍵，若發酵溫度過低，微生物生長代謝緩慢，SOD及各種產物含量較低；溫度過高，高溫會抑制微生物中酶的活性，進而抑制微生物的生長代謝，所產生的SOD及各產物量低[6]，也可能會造成發酵不徹底，且易受有害微生物的污染，進而影響酵素的品質[7]。目前對蘋果酵素的研究主要包括天然發酵過程中代謝產物、抗氧化活性的變化，短期發酵工藝對蘋果酵素抗氧化活性的影響等[8-10]，而關于發酵溫度對蘋果酵素抗氧化性和安全性的影響研究未見報道。本文以蘋果為發酵原料，接種本課題組自主研制的益生菌劑，研究發酵溫度對蘋果酵素品質的影響，獲得較優的發酵溫度，以期為蘋果酵素工業化生產提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小金蘋果，紅糖（什邡市益康食品有限公司），均為市售；益生菌劑為本項目組自行研制，由干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）Q16、哈伯氏乳桿菌（Lactobacillus harbinensis）QH21、屎腸球菌（Enterococcus faecium）QH19、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）QH1、釀酒酵母QH2、釀酒酵母QH18、枯草芽孢桿菌QH10、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QH12組成，分別按質量比2:20:35:5:15:15:3:5制成的菌劑；SOD檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗設計

1.2.1 蘋果酵素的制備 以無菌水沖洗蘋果，切絲、陰干備用，發酵體系中蘋果:紅糖:水的質量比為2:1:1，益生菌劑按0.5 %（m:m）接種，分別置于10，20，25，30，35 ℃培養箱中發酵120 d。發酵原料基本理化性質見表1。

1.2.2 樣品采集 發酵結束時取發酵液50 ml，7000 r/min離心5 min，取上清測定。

1.2.3 測定方法 采用紫外分光光度法測定維生素C[11]；福林酚法測定總酚[12]；采用pH試差法測定花色苷[13]；鐵氰化鉀還原法測定還原力[14]；參考文獻[1]測定超氧自由基清除率、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率；采用試劑盒測定SOD；參照（GB/T5009-2016）方法測定甲醇、甲醛[15]；采用酶聯免疫吸附法測定黃曲霉毒素B1[16]；參照GB 4789.3-2016測定大腸菌群數，參照GB 4789.10-2016測定金黃色葡萄球菌數，參照GB 4789.4-2016測定沙門菌[17]。每個試樣重復測定3次。

1.3 數據處理

用Excel 2010對實驗數據進行基本處理，SPSS 22.0進行主成分相關性分析、模糊數學分析。

2 結果

2.1 蘋果酵素的抗氧化性

2.1.1 抗氧化指標 維生素C、總酚、花色苷、SOD等抗氧化物質具有抑制自由基的產生或直接清除清除基、激活抗氧化酶體系等作用[1-2]。檢測蘋果酵素的維生素C含量、總酚含量、花色苷含量、SOD活性、還原力、羥自由基清除能力、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率，結果見表2。

由表2可見，發酵溫度為10～25 ℃時，隨著溫度升高，維生素C、總酚、花色苷含量增加、SOD活力升高；發酵溫度為25 ℃時，維生素C、總酚、花色苷含量、SOD活力達最大值；發酵溫度高于25 ℃時，維生素C和總酚含量、SOD活力降低。表明發酵溫度為25 ℃時蘋果酵素的抗氧化物質含量最高。

表1 發酵原料基本理化性質

表2 5組蘋果酵素的抗氧化指標

發酵溫度為25 ℃時，超氧自由基清除率、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率均高于其他各組（P＜0.01）；還原力高于其他各組（P＜0.05，P＜0.01），表明發酵溫度為25 ℃時，蘋果酵素的抗氧化活性相對較高。

2.1.2 主成分分析 對維生素C、總酚、花色苷、SOD 4種抗氧化物質和還原力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除4種抗氧化活性體系進行主成分相關性分析，利用SPSS 22.0軟件計算相關性結果、主成分特征值、方差貢獻率和累積貢獻率，結果見圖1。

圖1 主成分分析載荷圖

由圖1可見，共提取出2個主成分，第一主成分特征值為5.98，方差貢獻率達74.7 %，其中影響載荷權數大小依次為SOD活力、DPPH自由基清除率、總酚含量、花色苷含量、羥自由基清除率；第二主成分特征值為1.22，方差貢獻率為15.2 %，各指標所占載荷權數較小；2個主成分累計貢獻率達89.9 %，其他主成分的貢獻率可忽略不計。其中第一主成分中總酚含量與羥自由基清除率位置近，相關性高；第二主成分中花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除位置近，相關性高。表明酵素中花色苷、總酚、SOD具有一定抗氧化活性。

2.1.3 模糊數學分析 通過模糊數學分析法對5組酵素的抗氧化物質含量和抗氧化活性體系的數據進行無因次化處理。采用標準離差法計算權重。模糊轉化矩陣R見表3。通過等權和加權法分別對5組酵素的抗氧化性進行比較，5組酵素指標的評分結果見表4。

綜合分析結果取等權和加權的和，其中評分越高表示該組抗氧化性越高。由表4可見，5組酵素在不同發酵溫度下抗氧化指標評判排序依次為25 ℃＞30 ℃＞20 ℃＞10 ℃＞35 ℃，即在25 ℃發酵條件下蘋果酵素的抗氧化性最高。

2.2 有害指標

酵素在發酵過程中會產生甲醇、甲醛等有害物質，且易受致病微生物的污染，嚴重影響酵素品質。本文以甲醇、甲醛、黃曲霉毒素、大腸桿菌菌群、金黃色葡萄球菌、沙門菌為有害指標，評判酵素的安全性，5組酵素中有害指標結果及比較結果見表5。

表3 模糊轉化矩陣R

表4 模糊數學分析法結果及排序

由表5可見，發酵溫度為10～35 ℃時，甲醇和甲醛含量隨發酵溫度升高而增高，表明發酵溫度高可促進甲醇和甲醛生成，35 ℃時，酵素中甲醇和甲醛含量最高，但均分別低于0.40 mg/ml和2.00 μg/ml，符合GB2758-2012的要求。各組均未檢出黃曲霉毒素及有害微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌），均符合GB2761-2017和GB2758-2012的要求，表明10～35 ℃均為適宜的發酵溫度，但為了提高酵素的安全性，10～25 ℃為蘋果酵素較適宜的發酵溫度。

3 討論

發酵溫度通過影響微生物的活性及抗氧化物質的合成、氧化和分解速度，進而影響抗氧化物質的含量。發酵溫度為10～25 ℃時，微生物生長代謝速率隨溫度升高而加快，促進蘋果中維生素C、花色苷等物質的溶出，且微生物在生長代謝時會產生一定量的維生素C、酚類、花色苷等抗氧化物質[3,12]，使體系中抗氧化物質含量逐漸增加，SOD活力增強；發酵溫度為10 ℃時，酵素中微生物活性低，抑制了抗氧化物質的溶出或產生，抗氧化物質含量低；發酵溫度為25 ℃時，酵素中維生素C、總酚、花色苷含量達最大值，分別為41.70 mg/ml，2.11 mg/ml，61.11 mg/L，SOD活力達267.25 U/L。發酵溫度為25～35 ℃時，升高發酵溫度雖有利于提高微生物的活性，促進維生素C、酚類等抗氧化物質的溶出或產生，但維生素C、酚類、花色苷等物質易受溫度影響，隨溫度升高其氧化或分解速度加快[12-13]，含量逐漸降低。因此發酵溫度為25 ℃時，酵素中抗氧物質產生或分解速度適中，更好地維持體系中抗氧化物含量，使得該組的抗氧化性物質含量最高。

通常將還原力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率作為酵素的抗氧化活性體系，抗氧化活性高低與抗氧化物質的含量密切相關，但不同的抗氧化物質和抗氧化活性相關程度不同[1]。主成分分析抗氧化物質的含量和抗氧化活性的相關性結果（圖1）表明，總酚和羥自由基清除率呈顯著正相關，花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除率呈顯著正相關（P＜0.05），而維生素C含量與總酚含量、花色苷含量、SOD活力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率及DPPH自由基清除率的相關性不大，即總酚、花色苷、SOD活力對酵素體系的抗氧化活性影響較大。本文研究結果顯示，發酵溫度為25 ℃時，總酚含量、SOD活力、花色苷含量最高，表明該組的抗氧化活性最高。

表5 5組蘋果酵素中的有害指標

蘋果皮中的果膠質在甲酯酶作用下水解產生甲醇；甘氨酸脫羧生成甲醇；果酸物質受熱分解產生甲醇[18-19]。甲醛是酵母菌的一種代謝產物，酵素中甲醛主要來自于甲醇的氧化脫氫，在甲醛脫氫酶的作用下又繼續氧化成甲酸，然后在甲酸脫氫酶作用下繼續氧化生成二氧化碳[20]。發酵過程中過量甲醇和甲醛的產生易對人體造成傷害[15]。發酵溫度主要通過影響甲酯酶、甲醇脫氫酶等多種酶活性，進而影響甲醇和甲醛的含量。10～35 ℃時，隨發酵溫度升高，甲醇含量逐漸增加，這是由于發酵溫度升高使甲酯酶、蛋白酶等多種酶活性增強，繼而對果膠等物質分解徹底，產生大量的甲醇，甲醇再進一步轉化為甲醛，使甲醛含量增加； 35 ℃時，甲醇和甲醛含量達最高（P＜0.05）。因此，發酵溫度越低，酵素中甲醇和甲醛含量越低，但為了提高蘋果酵素的品質，建議發酵溫度為25 ℃。

4 結論

發酵120 d時蘋果酵素中各指標趨于穩定，發酵溫度為25 ℃時，酵素中的花色苷含量、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原力、SOD活力均最高；總酚含量和羥自由基清除率呈顯著正相關，花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除率呈顯著正相關（P＜0.05）；5組酵素中有害物質和有害微生物均符合國家相關標準；模糊數學綜合評判結果為25 ℃發酵條件下，蘋果酵素的抗氧化性最高，品質最優。