泛素偶聯(lián)酶E2C在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

董文亮，劉洪濤，初侃，侯鐵偉，肖遙

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位于世界惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，致死率第2位，以乙肝細(xì)胞癌或丙肝細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，約占80%[1-2]。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，我國(guó)原發(fā)性肝癌患者術(shù)后5年生存率約10%[3]。因此研究原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物，為原發(fā)性肝癌及時(shí)診斷、治療和預(yù)后提供依據(jù)迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)，泛素偶聯(lián)酶E2C(UBE2C)過(guò)表達(dá)能夠抑制細(xì)胞有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)，破壞其監(jiān)測(cè)功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲[4-5]。近幾年研究表明，UBE2C在乳腺癌、胃癌、食管鱗癌組織中高表達(dá)[6-8]，而在原發(fā)性肝癌中表達(dá)水平及與預(yù)后關(guān)系未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道。因此，現(xiàn)分析原發(fā)性肝癌組織UBE2C表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)及術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月—2016年12月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普外科手術(shù)治療原發(fā)性肝癌患者109例(肝癌組)，術(shù)中留取原發(fā)性肝癌組織3 mm3，同時(shí)取距原發(fā)性肝癌組織5 cm處同體積正常肝臟組織為癌旁組。患者中男59例，女50例，年齡39～75(55.24±6.49)歲；病程3～15(8.24±2.93)個(gè)月；嗜酒31例(28.44%)；肝炎病毒感染89例(81.65%)；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期69例；分化程度：高中分化39例，低分化70例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例；有淋巴結(jié)血管間隙浸潤(rùn)54例，無(wú)浸潤(rùn)55例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)性肝癌[9]；②患者臨床資料完整、詳細(xì)，能夠接受術(shù)后隨訪；③無(wú)既往治療史和家族遺傳史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①腎功能異常患者；②并發(fā)其他惡性腫瘤患者；③伴有心臟病、糖尿病患者；④合并其他原因引起的肝硬化、肝腺瘤等。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 UBE2C表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組化法測(cè)定UBE2C在原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織中表達(dá)水平。病理標(biāo)本均由同一病理科醫(yī)生獨(dú)立完成。使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2016型，德國(guó)徠卡公司)常規(guī)制作原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織石蠟切片(厚度約4 mm)，常溫下用3% H2O2阻斷切片中過(guò)氧化氫酶活性，修復(fù)抗原，PBS清洗3次，加入U(xiǎn)BE2C單克隆抗體(武漢維克賽思科技有限公司)，置于4℃冰箱中過(guò)夜，加入二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，25℃孵育30 min，隨后加入鏈霉親和素—過(guò)氧化物酶室溫孵育15 min，PBS清洗3次，用DAB顯色，最后用蘇木素復(fù)染，60%、80%、90%、100%乙醇梯度洗脫脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，SPCC-200型生物顯微鏡(購(gòu)自東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司)觀察，用試劑盒提供的陽(yáng)性病理切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.3.2 隨訪情況：對(duì)所有患者進(jìn)行3年隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年12月31日，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時(shí)間，隨訪方式為入戶(hù)、電話(huà)隨訪，隨訪內(nèi)容為患者生存情況、病情變化等。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果采用半定量法進(jìn)行判定，即通過(guò)所取切片的陽(yáng)性染色深度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比來(lái)共同決定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別由3位專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立判斷評(píng)定，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)描述UBE2C表達(dá)水平。判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：UBE2C陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕色至棕褐色顆粒，大部分均勻分布在胞核或位于核膜下方，部分呈小斑塊不規(guī)則分布。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分：樣品無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。在顯微鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，記錄細(xì)胞數(shù)，按照陽(yáng)性染色細(xì)胞所占百分比評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性染色細(xì)胞所占比例<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性染色細(xì)胞所占百分比的評(píng)分相乘，根據(jù)二者乘積大小將免疫組化結(jié)果進(jìn)行等級(jí)劃分：0～1分記為陰性(-)，2～3分記為弱陽(yáng)性(+)，4～6分記為陽(yáng)性(++)，7～9分記為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。其中陰性和弱陽(yáng)性記為UBE2C低表達(dá)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性記為UBE2C高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 2組UBE2C表達(dá)水平比較 免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，原發(fā)性肝癌組織中UBE2C陽(yáng)性表達(dá)率為92.66%(101/109)，顯著高于癌旁組織的64.22%(70/109)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.067，P=0.000)，見(jiàn)表1。

表1 原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織中UBE2C表達(dá)水平比較 [例(%)]

2.2 UBE2C表達(dá)水平在不同原發(fā)性肝癌臨床病理參數(shù)中比較 原發(fā)性肝癌組織中UBE2C的表達(dá)水平在患者的不同性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在不同TNM分期、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 UBE2C表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析 UBE2C表達(dá)水平與TNM分期、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)呈正相關(guān)(r/P=0.506/0.000、0.517/0.000、0.493/0.002)。

2.4 不同UBE2C表達(dá)水平原發(fā)性肝癌患者生存率比較 UBE2C高表達(dá)原發(fā)性肝癌患者中位生存時(shí)間為23.32個(gè)月，顯著短于UBE2C低表達(dá)患者的33.32個(gè)月(χ2=9.129，P=0.003)， 見(jiàn)圖1。

圖1 不同UBE2C表達(dá)水平原發(fā)性肝癌患者生存率比較

2.5 影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 多因素分析結(jié)果表明，有淋巴血管間隙浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及UBE2C高表達(dá)的原發(fā)性肝癌患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于無(wú)淋巴血管間隙浸潤(rùn)、未復(fù)發(fā)及UBE2C低表達(dá)的患者(OR=2.880、2.975、3.475，P均<0.05)， 見(jiàn)表3。

表2 UBE2C表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [例(%)]

表3 影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

全世界每年新增原發(fā)性肝癌患者約900萬(wàn)，其中我國(guó)約400萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人民的身體健康[11]。原發(fā)性肝癌患者臨床表現(xiàn)為肝部刺痛或持續(xù)性鈍痛，并伴隨腹脹，目前臨床上對(duì)原發(fā)性肝癌主要采用以手術(shù)為主，化療、放療、分子靶向治療為輔的策略[12]。原發(fā)性肝癌早期臨床表現(xiàn)不明顯，導(dǎo)致難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療，因而大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，術(shù)后預(yù)后差[13-14]，因此臨床上急需探尋一種分子標(biāo)志物用于原發(fā)性肝癌患者預(yù)后判斷及靶向治療，以改善原發(fā)性肝癌患者不良預(yù)后，提高生存率。

UBE2C類(lèi)屬于人泛素偶聯(lián)酶家族，通過(guò)對(duì)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核等處蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶體和泛素化酶調(diào)控發(fā)揮作用[15-16]。UBE2C能夠參與細(xì)胞有絲分裂和周期蛋白相關(guān)因子的泛素化進(jìn)程，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的功能，其高表達(dá)可誘導(dǎo)胞內(nèi)功能蛋白質(zhì)降解，破壞細(xì)胞染色體組結(jié)構(gòu)，在腫瘤組織中的異常表達(dá)逐漸引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌組織中UBE2C陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，表明UBE2C水平上調(diào)可能與原發(fā)性肝癌發(fā)生有關(guān)。Nicolau-Neto等[17]研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中UBE2C過(guò)表達(dá)，瘤旁組織中低表達(dá)，UBE2C可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白B1水平，影響食管鱗癌細(xì)胞增殖和周期，有望成為腫瘤生物標(biāo)志物候選物。本研究提示，UBE2C也可能通過(guò)調(diào)控B1等相關(guān)蛋白表達(dá)影響染色體結(jié)構(gòu)和肝癌細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖等，影響肝癌發(fā)生。馮力[18]研究表明，UBE2C在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，且與神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期、復(fù)發(fā)相關(guān)，提示UBE2C可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)進(jìn)程中發(fā)揮作用[18]。本研究結(jié)果顯示，UBE2C在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)水平與患者TNM分期、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果相似，提示原發(fā)性肝癌組織中UBE2C高表達(dá)還可能預(yù)示肝癌分期升高、轉(zhuǎn)移發(fā)生及患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加，該過(guò)程可能與UBE2C水平升高引起癌細(xì)胞周期異常改變有關(guān)。

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，UBE2C在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著升高，與患者生存期有關(guān)[19]。翁鴻等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌變組織中UBE2C基因高表達(dá)組患者的預(yù)后差于低表達(dá)組，提示UBE2C高表達(dá)與膀胱癌患者不良預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，UBE2C高表達(dá)原發(fā)性肝癌患者中位生存時(shí)間顯著短于低表達(dá)患者，與上述研究結(jié)果一致，提示UBE2C高表達(dá)可能與原發(fā)性肝癌患者生存時(shí)間短等不良預(yù)后發(fā)生有關(guān)，UBE2C可能成為評(píng)價(jià)原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的臨床指標(biāo)。本研究還通過(guò)COX多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，有淋巴血管間隙浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及UBE2C高表達(dá)的原發(fā)性肝癌患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于無(wú)淋巴血管間隙浸潤(rùn)、未復(fù)發(fā)及UBE2C低表達(dá)患者，進(jìn)一步提示UBE2C水平升高可能預(yù)示原發(fā)性肝癌患者不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)增加，應(yīng)對(duì)UBE2C高表達(dá)患者定期檢查，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療，減少不良預(yù)后發(fā)生。

綜上所述，UBE2C在原發(fā)性肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，與原發(fā)性肝癌患者TNM分期、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及生存情況相關(guān)，有望成為原發(fā)性肝癌預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)，但是UBE2C參與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

董文亮：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；劉洪濤：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；初侃：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；侯鐵偉：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；肖遙：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)