干熱法滅活對(duì)新型冠狀病毒肺炎相關(guān)炎癥指標(biāo)檢測(cè)的影響

趙明海，李 欣，魏 東，羅 敏，張雅潔，楊懿祺，鄭 磊

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510515）

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）已對(duì)我國(guó)及全世界人民的健康造成了巨大的威脅[1-3]。我國(guó)已將其納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并按照甲類傳染病管理。SARSCoV-2的主要傳播途徑是經(jīng)呼吸道飛沫傳播，亦可通過(guò)接觸傳播（手-口、糞-口），同時(shí)可能存在氣溶膠傳播[4]。目前，對(duì)于COVID-19的診斷、病情評(píng)估及監(jiān)測(cè)主要根據(jù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，其中檢測(cè)過(guò)程中的拔蓋步驟存在氣溶膠傳播的高風(fēng)險(xiǎn)[5]。拔蓋前對(duì)病毒滅活可有效降低其傳播風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)檢驗(yàn)人員的安全。目前認(rèn)為56 ℃ 30 min可對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行滅活，已有報(bào)道56 ℃ 30 min滅活處理血液樣本對(duì)免疫層析法及化學(xué)發(fā)光免疫分析法SARS-CoV-2抗體檢測(cè)、咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響[6-7]。由于COVID-19診療過(guò)程中涉及的實(shí)驗(yàn)室檢查不僅包括核酸檢測(cè)、抗體檢測(cè)，其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)也十分重要，其中炎癥標(biāo)志物不僅對(duì)COVID-19的鑒別診斷意義重大，對(duì)COVID-19重癥患者的病情評(píng)估及用藥指導(dǎo)也十分重要。白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）可以作為判斷疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的生物標(biāo)志物[8]，C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和降鈣素原（procalcitonin，PCT）可以作為鑒別診斷細(xì)菌、病毒感染的輔助指標(biāo)[9-11]。白露等[12]發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子刺激和釋放治療會(huì)使相關(guān)指標(biāo)水平升高，56 ℃ 30 min水浴法滅活對(duì)CRP和PCT的檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，對(duì)IL-6的檢測(cè)結(jié)果有影響。但該研究樣本量較小，且樣本采集是使用帶分離膠的試管，并從離心后的樣本中分離出1/2血清作為滅活后檢測(cè)的樣本，而臨床大部分實(shí)驗(yàn)室是使用樣本采集管而非帶分離膠的試管，滅活是在樣本拔蓋前進(jìn)行，凝集后紅細(xì)胞及分離血清在同一試管內(nèi)。本研究擴(kuò)大了樣本量，并通過(guò)模擬臨床實(shí)際進(jìn)行滅活前處理，即收集臨床中已進(jìn)行過(guò)CRP、PCT和IL-6檢測(cè)的樣本，蓋上帽蓋后立即進(jìn)行滅活并再次檢測(cè)，進(jìn)一步明確干熱法滅活對(duì)COVID-19診療常用炎癥指標(biāo)的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2020年3月2日—5月28日南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行過(guò)CRP、PCT和IL-6檢測(cè)，且結(jié)果盡量覆蓋線性范圍的無(wú)脂血、溶血的臨床剩余血樣本332例，其中CRP檢測(cè)樣本104例、PCT檢測(cè)樣本124例、IL-6檢測(cè)樣本104例。采集靜脈血后，2 191×g離心10 min，收集分離的血清進(jìn)行檢測(cè)。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)（倫理號(hào)：NFEC-2018-144）。

1.2 儀器與試劑

靜脈血樣本采集管購(gòu)自成都瑞奇科技實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司。IL-6和PCT采用cobas e602全自動(dòng)電化學(xué)法發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光雙抗體夾心法）檢測(cè)，CPR采用cobas e7500全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（顆粒增強(qiáng)投射免疫比濁法）檢測(cè)。干熱滅活儀器為DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

在當(dāng)天室內(nèi)質(zhì)控合格的前提下，收集當(dāng)天符合納入要求、已檢測(cè)CRP、PCT和IL-6且經(jīng)過(guò)審核的剩余血樣本，蓋上帽蓋后放入干燥箱進(jìn)行56 ℃ 30 min干熱滅活，使用經(jīng)校準(zhǔn)的溫度計(jì)分別在滅活前、后對(duì)干燥箱溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。滅活后將帽蓋拔去，當(dāng)天重新對(duì)樣本進(jìn)行CRP、PCT和IL-6檢測(cè)，并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 23.0及GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，組間比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估滅活前、后檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，采用Bland-Altman法進(jìn)行一致性分析，以≥95%的散點(diǎn)位于差值的95%可信區(qū)間內(nèi)為有一致性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干熱法滅活對(duì)CRP、PCT及IL-6檢測(cè)結(jié)果的影響

與滅活前比較，332例樣本滅活后均未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血現(xiàn)象。CRP滅活前、后檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.456），PCT、IL-6滅活前、后檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；PCT經(jīng)滅活后有98例樣本水平下降，其中5例超過(guò)參考區(qū)間的樣本滅活后檢測(cè)結(jié)果降至參考區(qū)間內(nèi)（滅活前分別為0.050、0.053、0.056、0.058 及0.600 ng/mL，滅活后分別為0.040、0.046、0.049、0.047及0.042 ng/mL），1例處于醫(yī)學(xué)決定水平附近（0.5 ng/mL）的樣本經(jīng)滅活后低于醫(yī)學(xué)決定水平（由0.503 ng/mL降為0.478 ng/mL）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 滅活前、后3項(xiàng)炎癥指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

圖1 滅活前、后散點(diǎn)圖

2.2 滅活前、后檢測(cè)結(jié)果的一致性和相關(guān)性

Bland-Altman圖分析結(jié)果顯示，PCT、CRP及IL-6分別有96.77%、97.11%及97.11%的散點(diǎn)位于差值的95%可信區(qū)間內(nèi)，干熱法滅活前、后檢測(cè)結(jié)果結(jié)果具有一致性（相對(duì)偏移分別為0.431%、0.141%、2.133%），見(jiàn)圖2。滅活前、后PCT、CRP、和IL-6的檢測(cè)結(jié)果均呈正相關(guān)（r值分別為0.992、0.999、0.966，P＜0.05）。

圖2 熱滅活前、后一致性分析

3 討論

由SARS-CoV-2引起的疫情嚴(yán)重威脅著全世界人民的生命安全，盡管明確的接觸史、全身癥狀和肺炎的影像學(xué)改變可基本確定COVID-19，但實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果仍是COVID-19確診的金標(biāo)準(zhǔn)。由于SARS-CoV-2具有極強(qiáng)的傳染性，檢驗(yàn)人員在處理各種樣本時(shí)面臨極大的感染風(fēng)險(xiǎn)。如何減少檢驗(yàn)工作人員的感染風(fēng)險(xiǎn)，保證實(shí)驗(yàn)室生物安全，引起了臨床實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注。目前認(rèn)為SARS-CoV-2的傳播途徑除經(jīng)呼吸道飛沫傳播、接觸傳播外，還可能存在氣溶膠傳播，特別是在相對(duì)封閉的實(shí)驗(yàn)室中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠時(shí)，感染風(fēng)險(xiǎn)有可能增加[14]。盡管《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第二版）》[15]要求未經(jīng)滅活的COVID-19患者相關(guān)臨床樣本的血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)，但也不能完全保證檢驗(yàn)人員的安全。

目前，學(xué)者們認(rèn)為SARS-CoV-2對(duì)紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可對(duì)其有效滅活[4]。因此，在樣本開(kāi)蓋之前對(duì)其進(jìn)行滅活可有效減少檢驗(yàn)工作人員操作風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，56 ℃ 30 min滅活后，261例樣本并未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血現(xiàn)象，滅活對(duì)CRP的檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，對(duì)PCT、IL-6有影響，與劉兆宇等[13]報(bào)道的加熱滅活對(duì)PCT檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響的結(jié)論不一致。本研究124例PCT樣本經(jīng)滅活處理后，有98例水平下降，其中5例超過(guò)參考區(qū)間的樣本滅活后檢測(cè)結(jié)果降至參考區(qū)間內(nèi)。有研究結(jié)果表明，在樣本采集24 h后，PCT水平在室溫下大約下降12%，4 ℃條件下大約下降6%[16]。由此可見(jiàn)，加熱滅活可能會(huì)加快PCT水平的下降。此外，PCT、IL-6、CRP滅活前、后檢測(cè)結(jié)果的一致性及相關(guān)性顯著。因此，臨床上可考慮使用不帶分離膠的常規(guī)采血管對(duì)CRP進(jìn)行滅活處理，但對(duì)PCT及IL-6進(jìn)行滅活需慎重。值得注意的是，由于PCT滅活后結(jié)果存在下降趨勢(shì)，對(duì)于處于參考區(qū)間臨界值及醫(yī)學(xué)決定水平附近的結(jié)果需要謹(jǐn)慎處理。

相較已有的研究報(bào)道，本研究從臨床更為常見(jiàn)的情境出發(fā)，包括使用臨床上多采用的不帶分離膠的采血管，離心后凝集的紅細(xì)胞和血清在同一試管內(nèi)等情況，對(duì)COVID-19診療中用于檢測(cè)3項(xiàng)炎癥指標(biāo)的樣本進(jìn)行滅活處理，評(píng)估其操作可行性。本研究也存在一些局限性：（1）本研究只是提供策略參考，受不同儀器及檢測(cè)原理的影響，不同實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)自身?xiàng)l件評(píng)估滅活對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；（2）大多臨床實(shí)驗(yàn)室CRP與血常規(guī)合并使用乙二胺四乙酸抗凝管、全血模式檢測(cè)，尤其在發(fā)熱門(mén)診，但由于本實(shí)驗(yàn)室尚未開(kāi)展此類檢測(cè)，因此該類樣本滅活方式及檢測(cè)結(jié)果一致性需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)模擬臨床常見(jiàn)滅活前處理流程，發(fā)現(xiàn)56 ℃ 30 min干熱滅活對(duì)CRP檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，對(duì)PCT、IL-6檢測(cè)結(jié)果有影響。本研究結(jié)果可為擬通過(guò)加熱滅活減少實(shí)驗(yàn)室SARS-CoV-2檢測(cè)樣本傳染性風(fēng)險(xiǎn)的前處理流程提供可行性參考，在防護(hù)物資有限的情況下，干熱法滅活可有效降低感染風(fēng)險(xiǎn)，保證檢測(cè)人員安全。