血漿ctDNA檢測在結直腸癌診療中的應用

陳馨寧，鄔升超，郭 瑋，王蓓麗

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

結直腸癌全球發病率和死亡率分別居第3位和第4位[1]。結直腸癌的發生、發展被認為是由環境因素以及遺傳學和表觀遺傳學的積累所導致的[2]。常見結直腸癌治療方式有手術切除、放療、化療以及分子靶向治療[3]。在常見治療手段中，分子靶向治療由于其較低的毒性反應、更強的靶向性、更好的療效，在結直腸癌治療中獲得更多關注。在臨床制定治療策略前，通常推薦對腫瘤原發灶及轉移灶進行活檢，然而由于受制于取樣差異、腫瘤異質性、無法反復多次取樣[4]以及其創傷性等缺點，越來越多的研究者將注意力放在了能夠彌補組織活檢不足的液體活檢上[5-7]。

1 液體活檢與ctDNA

不同于腫瘤組織活檢，液體活檢是針對患者體內循環系統的一類非侵入性病理檢測方法。液體活檢操作簡便、無創、實時，可多次實施，具有替代傳統活檢的潛質[8]。液體活檢在未來醫學的早期診斷、治療選擇、預后監測、療程指導等領域都具有巨大的潛力。很多體液，如血液、尿液、腦脊液等都可以作為液體活檢的標本，其中從血液中分離出的一系列物質經過分子分析可以得到獨特的、補充性的信息[7]。根據診斷標志物種類將液體活檢領域進行細分，通常會把液體活檢領域劃分為3個主要方面：循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）。

ctDNA來自于壞死腫瘤細胞、凋亡腫瘤細胞、循環腫瘤、腫瘤細胞分泌的外泌體[9]。ctDNA帶有腫瘤原發灶或轉移灶的生物信息（包括突變、重排、甲基化等），血液中的ctDNA數量和性質受到多種因素影響，腫瘤分期越高、負荷越大，ctDNA檢出率越高[10-11]。ctDNA片段大小為70～200 bp，通常大于非腫瘤性循環游離DNA，半衰期為16 min～2.5 h。ctDNA可用于監測手術或化療后癌癥患者的腫瘤動態，這種個性化的基因檢測方法也普遍適用于其他類型的癌癥個體[12]。選擇靈敏度和特異性高周轉時間較短的液體活檢技術，能夠使臨床醫生及時獲得可能對患者進行前瞻性或者隨訪有用的信息[13]。

2 ctDNA的常見檢測平臺

隨著對ctDNA研究熱度的不斷攀升，各種高靈敏度和高特異性的檢測手段被開發出來，使檢測低豐度的ctDNA成為可能。目前常見的檢測手段有：磁珠乳液擴增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）、微滴式數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、下一代測序（next-generation sequencing，NGS）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight，MALDI-TOF）、擴增阻滯突變系統聚合酶鏈反應（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）等。見表1。

BEAMing是第1種通過臨床驗證的液體聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）活檢技術，其檢測結直腸癌患者中RAS突變狀態的能力已通過CE認證。BEAMing是將單個獨立的DNA分子同油包水乳液中的磁珠相連接，隨后進行PCR擴增，然后通過與特定的突變型或野生型熒光等位基因特異性探針雜交來確定與磁珠結合的DNA的突變狀態，最后采用流式細胞術來檢測存在于血漿中的突變體DNA的水平[8，14]。

ddPCR是將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納米級的微滴，經PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度[15]。

NGS是采用邊合成邊測序的策略將數百萬DNA模板同時進行測序，基于大規模平行測序技術，大幅提高了效率，并使成本顯著下降[16]。NGS是目前基因研究的主要方法之一，運用NGS進行基因組DNA序列分析和風險預測，在腫瘤研究領域作出了極大貢獻[17]。

質譜是一種高特異性和準確性的分析技術，可用于確定原子和分子的質量、分析分子的元素組成、闡明分子的化學結構[18]、通過測定離子飛行時間得到離子的質荷比、檢測離子。MALDI-TOF近年來被廣泛應用于核酸分子診斷領域，如唐氏綜合征篩查、病原體分型檢測、腫瘤藥物基因突變檢測等[19-20]。

ARMS-PCR的基本原理是由于TaqDNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，在一定條件下PCR引物3'末端的錯配導致產物的急劇減少，針對不同的已知突變，設計適當的引物，通過PCR直接達到區分突變型和野生型基因的目的[21]。

表1 ctDNA檢測方法比對

3 ctDNA在結直腸癌診療中的應用

3.1 ctDNA對結直腸癌患者預后評估價值

當前監測結直腸癌復發的方法包括對血液中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的檢測，以及周期性電子計算機斷層掃描檢查。但是由于前者的低靈敏度、后者的輻射以及成本限制等，術后結直腸癌患者病灶狀況未能得到很好的監測[22]。

ctDNA是轉移性結腸直腸癌患者治療過程中頗具前景的生物標志物。有研究結果顯示，手術前所有受試者均可檢測到ctDNA，血液檢測結果顯示ctDNA水平的變化與手術切除范圍相關。手術后檢測出ctDNA的受試者一般在1年內復發。ctDNA可能是一個比目前的標準生物標志物CEA更可靠和敏感的指標[12]，可以提供早期干預的治療窗口[23]。

2項背靠背發表的基于ctDNA檢測微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）的文獻指出，評估Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者根治性術后ctDNA的突變情況，能有效預測患者復發風險[11，24]。2項研究都在術后采取了多點取樣監測的方式，并比較了不同的監測模式對預測復發風險的準確性，發現術后單點、輔助治療后單點和綜合多點隨訪監測這3種模式下，ctDNA陽性患者復發風險分別是ctDNA陰性患者的7倍、14倍和40倍，說明多點的ctDNA MRD監測是最有效預測復發風險的方式，準確性遠遠高于術后單點監測。這是首次有循證醫學證據充分證實這個論點，對于后續規范化MRD的臨床應用有重要意義。

3.2 ctDNA在結直腸癌個體用藥中的應用

結直腸癌細胞主要通過2種策略逃避表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）阻斷。第1種耐藥機制在43%的患者樣本和58.8%的細胞樣本中可被檢測到[25]。近來更多的證據顯示，KRAS第2號外顯子以外的突變以及NRAS突變也可以預測患者對西妥昔單抗和帕尼單抗（作用于EGFR的單克隆抗體）的耐藥。KRAS基因野生型患者可從抗EGFR單藥治療或聯合化療中獲益，但KRAS基因第2號外顯子的第12或13位密碼子發生突變者不能受益[26]。因此，專家組強烈建議對所有轉移性結直腸癌患者進行腫瘤組織（原發瘤或轉移灶均可）的KRAS/NRAS基因突變檢測。已知KRAS/NRAS突變的患者，均不應接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療，無論單藥還是與化療聯合，因為這些患者不但沒有機會從治療中獲益，而且還將面臨治療的毒性和費用[27-28]。一項Ⅲ期臨床研究對化療+貝伐珠單抗及化療+貝伐珠單抗+西妥昔單抗在轉移性結直腸癌中一線治療的療效進行對比，發現BRAF突變型的患者在這2種治療中療效都不好，中位無進展生存時間（progression-free survival，PFS）及總生存期（overall survival，OS）都遠低于野生型患者[29]。

第2種耐藥機制涉及EGFR細胞外結構域突變，在10.8%的患者樣本和29%的細胞中可被檢測到[25]。EGFR基因胞外域也發現了與耐藥相關的基因突變。V441D和V441GEGFR突變體與野生型EGFR相比，西妥昔單抗和帕尼單抗的結合力顯著降低[30]；G465R或G465EEGFR序列突變對受體細胞外部的結構域Ⅲ產生影響且結構分析表明，這些突變可能影響西妥昔單抗的結合[31]；S492REGFR細胞外域突變將干擾西妥昔單抗的結合并且產生抗藥性[32]。

綜上所述，結直腸癌患者ctDNA的檢測和監測對患者預后管理、治療選擇和療效評估至關重要。ctDNA中檢測到的突變狀況對制定治療方案具有啟示意義，將ctDNA作為生物標志物是非常有前景的，會使臨床和患者受益。因此，需要盡快建立標準化的、可被醫生和患者接受的檢測方式和結果解讀指南。