Xpert MTB/RIF技術在結核分枝桿菌利福平耐藥性快速檢測中的價值

劉 軍，劉 濤，戴碗琴，王藝翔，侯彥強

（上海市松江區中心醫院檢驗科，上海 201600）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，是人類第九大死因，死亡率在傳染性疾病中排名第一[1]，目前沒有任何疫苗能有效預防成人結核病。我國是全球30個結核病高負擔國家之一，每年新發結核病病例約90萬例，居全球第3位[2]。我國結核病防治的主要挑戰是耐多藥結核病發現率低、病原學確診率低、篩查率低、耐藥率高。傳統的涂片和培養方法檢出率低、培養周期長。Xpert MTB/RIF技術可在2 h內檢測MTB及其對利福平的耐藥性[3]。本研究采用Xpert MTB/RIF技術對痰液樣本進行MTB及利福平耐藥性的檢測，評價Xpert MTB/RIF技術在耐多藥結核病快速診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2017年12月—2019年5月上海市松江區中心醫院1 573例初診疑似肺結核患者痰液樣本，剔除液體培養污染11例，剩余1 562例用于統計分析。患者男1 112例（71%），年齡（43±18）歲；女450例（29%），年齡（41±16）歲。根據WS 288—2017《肺結核診斷》[4]，肺結核的診斷以病原學（包括細菌學、分子生物學）檢查為主，結合流行病史、臨床表現、胸部影像、輔助檢查及鑒別診斷結果，綜合分析后做出臨床診斷，以病原學和病理學檢查結果為確診依據。

1.2 儀器與試劑

Xpert MTB/RIF GeneXpert系統（美國Cepheid公司），BACTEC MGIT 960系統及配套培養基、添加劑、消化液（美國BD公司），抗酸染液（珠海BASO公司）。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色法 留取初診疑似肺結核患者即時痰、夜間痰和次日晨痰各1份，按《結核病診斷實驗室檢驗規程》[5]進行直接涂片抗酸染色鏡檢。

1.3.2 液體培養法 取2 mL痰液經N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化處理，強力旋渦震蕩后室溫靜置，加入磷酸鹽緩沖液，3 000×g離心15 min，棄上清液，沉淀后制備成懸濁液，取0.5 mL接種于培養管，采用BACTEC MGIT 960系統進行培養。

1.3.3 Xpert MTB/RIF法 取1 mL黏稠或膿性痰液加入前處理管中，加入2倍處理液，旋緊螺旋蓋，強力旋渦震蕩后室溫靜置，充分液化后用專用無菌吸管吸取0.5 mL，緩慢加入Cartridge單獨反應盒內，采用Xpert MTB/RIF GeneXpert系統自動檢測，約2 h即可直接讀取MTB和利福平耐藥性結果，具體操作參照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[6]。

1.3.4 菌群鑒定和藥物敏感性確認 將液體培養陽性樣本送上海市疾病預防控制中心進行分枝桿菌鑒定（PNB法、TCH法和28 ℃培養）和一線抗結核藥物（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇）敏感性試驗（傳統比例法）。

1.3.5 結果判讀 直接涂片抗酸染色法結果根據抗酸染色量的多少判為4+、3+、2+、1+、條數和陰性；液體培養法根據BACTEC MGIT 960系統報陽情況，經抗酸染色鏡檢排除雜菌的污染后，再送上海市疾病預防控制中心進行菌群鑒定和藥物敏感性試驗；Xpert MTB/RIF法的結果以高、中、低、極低和未檢出5個量級來表示。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3種方法MTB檢測效能比較

2.1.1 3種方法檢測MTB的敏感性 Xpert MTB/RIF法、液體培養法和直接涂片抗酸染色法檢測MTB的敏感性分別為22.6%（353/1 562）、25.48%（398/1 562）和13.06%（204/1 562）。

2.1.2 3種方法MTB檢測結果一致性 Xpert MTB/RIF法與液體培養法的符合率為93.92%（1 467/1 562），差異無統計學意義（χ2=3.55，P＞0.05）；Xpert MTB/RIF法與直接涂片抗酸染色法的符合率為89.44%（1 397/1 562），差異有統計學意義（χ2=48.51，P＜0.001）。見表1。

表1 3種方法MTB檢測結果一致性 例

2.1.3 Xpert MTB/RIF法與液體培養法MTB檢測結果比較 1 562例初診疑似肺結核患者中，以液體培養法為標準，Xpert MTB/RIF法檢測204例直接涂片抗酸染色法陽性樣本MTB的敏感性和特異性分別為98.96%（190/192）和50.00%（6/12），與液體培養法比較檢測結果比較差異無統計學意義（χ2=0.841，P＞0.05）；Xpert MTB/RIF法檢測1 358例直接涂片抗酸染色法陰性樣本MTB的敏感性和特異性分別為66.99%（138/206）和98.35%（1 133/1 152），與液體培養法比較差異有統計學意義（χ2=7.635，P＜0.05）；Xpert MTB/RIF法檢測1 562例初診疑似肺結核患者痰液樣本MTB的敏感性為82.41%（328/398），特異性為97.85%（1 139/1 164），與液體培養法比較差異無統計學意義（χ2=3.55，P＞0.05）。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF法與液體培養法MTB檢測結果 例

2.2 Xpert MTB/RIF法MTB檢測效能分析

經上海市疾病預防控制中心菌群鑒定確認，188例液體培養陽性樣本中，171例檢出結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）、17例檢出非結核分枝桿菌（non-tuberculousMycobacterium，NTM）。Xpert MTB/RIF法的檢測敏感性為91.23%（156/171）、特異性為88.24%（15/17）、準確性為90.96%（171/188）。Xpert MTB/RIF法與上海市疾病預防控制中心菌群鑒定結果的比較差異無統計學意義（χ2=4.109，P＞0.05）。

2.3 Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性結果

經上海市疾病預防控制中心藥物敏感性試驗確認，171株MTC中，利福平敏感154株、耐藥17株，耐藥率為9.94%；Xpert MTB/RIF法檢測利福平敏感156株、耐藥15株，耐藥率為8.77%。Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥的敏感性為82.35%（14/17）、特異性為99.35%（1/154）。Xpert MTB/RIF法與傳統比例法藥物敏感性試驗結果比較，差異無統計學意義（χ2=0.138，P＞0.05）。

3 討論

目前，我國結核病診斷相關檢測方法中，傳統的直接涂片抗酸染色法陽性檢出率低，生物安全要求高，不能及時發現患者；液體培養法通過添加生長刺激劑，雖然提高了檢測敏感性、縮短了報陽時間，但仍需要2～6周的培養時間，無法滿足臨床診療的需求。隨著分子診斷技術的發展，Xpert MTB/RIF檢測技術具有較高的敏感性和特異性，在單獨的反應盒內檢測，操作簡單，生物危害度小，2 h內就可以檢測MTB及其對利福平的耐藥性[7]，對于臨床快速診斷和及時治療疾病具有重要意義。

本研究采用Xpert MTB/RIF法、液體培養和直接涂片抗酸染色法檢測1 562例初診疑似肺結核患者痰液樣本中的MTB，敏感性分別為22.6%、25.48%和13.06%，與張青等[8]的研究結論一致，但與劉慧梅等[9]的研究結果比較，3種方法陽性檢出率均較低，可能與選擇的檢測對象不同有關，本研究選取初診疑似肺結核患者為研究對象，而劉慧梅等的研究對象是經過臨床診斷的結核病患者。本研究Xpert MTB/RIF法與液體培養法檢測結果有較高的一致性（χ2=3.55，P＞0.05），敏感性顯著高于直接涂片抗酸染色法（χ2=48.51，P＜0.001），與徐東芳等[10]的研究結論一致。本研究以液體培養法為標準，在204例直接涂片抗酸染色法陽性樣本中，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的敏感性和特異性分別為98.96%和50.00%，與液體培養法比較差異無統計學意義（χ2=0.841，P＞0.05），與劉亞芹等[11]的研究結論一致；Xpert MTB/RIF法檢測1 358例直接涂片抗酸染色陰性樣本MTB的敏感性和特異性分別為66.99%和98.35%，與液體培養法比較差異有統計學意義（χ2=7.635，P＜0.05），與劉亞芹等[11]的研究結論不一致，可能與液體培養陽性樣本中存在NTM有關。經上海市疾病預防控制中心菌群鑒定確認，本研究188例液體培養陽性樣本中，17例檢出NTM，Xpert MTB/RIF法只檢出2例，15例檢測結果為陰性，與譚英征等[12]的研究結論一致。與液體培養法比較，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的敏感性為82.41%，特異性為97.85%，差異無統計學意義（χ2=3.55，P＞0.05），與趙金云等[13]的研究結論一致。本研究結果表明，對于直接涂片抗酸染色法陽性和陰性樣本，Xpert MTB/RIF法均有著較高的敏感性和特異性。

本研究以上海市疾病預防控制中心菌群鑒定結果為標準，Xpert MTB/RIF法鑒定菌群的敏感性為91.23%、特異性為88.24%、準確性為90.96%，與液體培養法檢測結果比較差異無統計學意義（χ2=4.109，P＞0.05），有較高的一致性，與杜安玲[14]的研究結論一致。

本研究以傳統比例法藥物敏感性試驗結果為金標準，Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性的敏感性為82.35%、特異性為99.35%，Xpert MTB/RIF法與傳統比例法比較差異無統計學意義（χ2=0.138，P＞0.05），有較高的一致性，與張玉華等[15]和宋世森[16]的研究結論一致。其中2例檢測結果不一致，可能與MTB利福平耐藥決定區域特定rpoB基因突變有關。

結核病的控制與早期篩查發現、合理規范治療密切相關，直接涂片抗酸染色法敏感性低、液體培養法耗時長，均難以做到早期發現、快速診斷。XpertMTB/RIF技術作為世界衛生組織認可的一種快速而靈敏的診斷結核病的方法，具有較高的檢測敏感性和特異性，操作簡單，生物危害性低，2 h即可檢測MTB，并篩查利福平耐藥性，對臨床快速診斷和合理、規范治療具有重要意義。 雖然儀器設備和檢測成本較高，對于耐藥性的篩查也僅限于利福平，不能同時篩查MTB對異煙肼等抗結核藥物的耐藥性，但與直接涂片法和液體培養法比較，在快速診斷和篩查方面邁出了一大步，且操作簡便，硬件設施要求低，適合在基層醫療機構結核病檢測實驗室大力推廣。