反相高效液相色譜法測定蒙藥材灰綠黃堇中原阿片堿含量*

郭寶鳳 ，周雪梅 △

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

蒙醫(yī)常用灰綠黃堇作“地格達(dá)”使用，效果較好，但作為蒙藥材，現(xiàn)暫無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，未能對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。灰綠黃堇（蒙醫(yī)名為柴布日-薩巴樂干納），為罌粟科紫堇屬植物灰綠黃堇Corydalis aduncaMaxim.的干燥全草，功能主治為清熱解毒、消炎、涼血、解毒、利尿，用于治療時(shí)疫感冒、咽喉腫痛、疔瘡腫痛等［1-5］。灰綠黃堇主要含有紫堇堿、去氫紫堇堿、二氫血根堿、延胡索乙素等多種生物堿類成分［3-5］，有鎮(zhèn)痛、止咳、松弛平滑肌、平喘、抗菌的作用［6-7］。本研究中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)蒙藥材灰綠黃堇中原阿片堿含量進(jìn)行了測定，為灰綠黃堇的質(zhì)量控制提供了定量檢測方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DionexU-3000型雙三元型高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測器，美國Thermo公司）；Sartorius ME5型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為百萬分之一）；Mettler AE-100型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為萬分之一）；AS 5150A型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

紫堇靈對(duì)照品（批號(hào)為111734-200601），延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)為110726-201213），鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)為110732-200506），原阿片堿對(duì)照品（批號(hào)為 110853-201404），鹽酸黃連堿對(duì)照品（批號(hào)為112026-201601），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為離子交換高純水；10批灰綠黃堇為蒙醫(yī)醫(yī)院提供或自采樣品，樣品信息見表1。所有樣品均由內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院主任中藥師周雪梅鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AlltimaC18-ODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至6.0，15 ∶85，V／V）；檢測波長：289 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 樣品信息來源

2.2 溶液制備

取原阿片堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取樣品粉末（過3號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為50 kHz）60 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取上述2種溶液各10 μL，分別注入色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的色譜峰且光譜圖一致。理論板數(shù)以原阿片堿峰計(jì)為10732，分離度為6.7。理論板數(shù)以原阿片堿峰計(jì)不小于4000。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：取原阿片堿對(duì)照品（含量為99.77%）5.388 mg，置 50 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，精密吸取 2，5，10，15，20 μL 注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A＝0.020 8C-0.026 60.040 8（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，原阿片堿進(jìn)樣量在107.44～1 611.5 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 灰綠黃堇反相高效液相色譜圖及光譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算原阿片堿峰面積積分值。結(jié)果的RSD為0.68%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于2，4，6，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，依法測定，計(jì)算原阿片堿峰面積積分值。結(jié)果的RSD為0.75%（n＝2），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品（S1）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定原阿片堿含量。結(jié)果原阿片堿平均含量為 1.588mg／g，RSD為 1.75%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一供試品（S1），含量為 1.588mg／g）6份，各1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液 25 mL（質(zhì)量濃度為 0.058 6 mg ／mL），精密加甲醇25 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定原阿片堿含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 原阿片堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

耐用性試驗(yàn)：換不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色柱譜為Alltima C18，Phenomenex C18，Agilent C18，Shimadzu C18，色譜柱分離度均大于 1.5，測得平均含量分別為 1.59，1.61，1.60，1.57 mg ／g。與本研究中采用的AlltimaC18柱測得平均含量（1.59mg／g）相對(duì)誤差分別為 0.62%，0.32% ，0.64% 。不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱對(duì)測定結(jié)果無影響。

2.4 樣品含量測定

取10批供試品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果見表3。）

表3 原阿片堿含量測定結(jié)果（mg／g，n＝2）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

本研究中對(duì)流動(dòng)相［甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH 至 6.0）、甲醇 -0.1%磷酸溶液、乙腈 -0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 至 6.0）、乙腈 -0.1%磷酸溶液］、柱溫（30℃、35℃、40℃）進(jìn)行考察。結(jié)果柱溫35℃、流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至6.0）的色譜條件下等度洗脫時(shí)，各色譜峰與相鄰峰分離較好，且基線平穩(wěn)。

3.2 檢測波長選擇

通過二極管陣列檢測器對(duì)對(duì)照品在800～190 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果原阿片堿在289.3 nm皮長處有最大吸收峰，參照文獻(xiàn)［2，6-7］。故選擇測定波長為289 nm。

3.3 指標(biāo)成分選擇

本研究中采用RP-HPLC法建立蒙藥材灰綠黃堇的含量測定，曾摸索鹽酸罌粟堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、原阿片堿的含量測定方法［8-14］。結(jié)果灰綠黃堇色譜圖中沒有與鹽酸罌粟堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素、鹽酸藥根堿保留時(shí)間一致的色譜峰，或雖保留時(shí)間一致，但光譜圖不同，供試品色譜圖中有與原阿片堿和鹽酸黃連堿保留時(shí)間一致的色譜峰，且光譜圖一致，分離效果較好，鹽酸黃連堿含量較低，故以原阿片堿為指標(biāo)成分建立含量測定方法。

3.4 提取方法選擇

比較了甲醇加熱回流和超聲提取2種方法，結(jié)果差異不明顯，因超聲提取更簡便、易行，故選擇超聲提取法。分別比較了甲醇浸泡1 h后超聲和直接超聲提取2種方法，結(jié)果差異不大，故選擇甲醇超聲提取。比較了超聲處理（功率為 250 W，頻率為 50 kHz）30，60，120 min，進(jìn)行試驗(yàn)，按擬訂色譜條件測定，結(jié)果超聲處理60 min后原阿片堿的含量不再增加，故確定超聲時(shí)間為60 min。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了測定原阿片堿含量的RP-HPLC法，該方法，簡便、準(zhǔn)確，可作為灰綠黃堇質(zhì)量控制的定量方法。