高效液相色譜法測定喉蛾散中鹽酸小檗堿含量

陳武軍

（福建省漳州市中醫院，福建 漳州 363000）

喉蛾散是由黃連、黃柏、桔梗、蜜甘草、琥珀、薄荷、硼砂、煅硼砂、珍珠、冰片、甘草、青黛、山豆根等中藥組方，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，適用于咽喉腫痛、口舌生瘡、牙齦腫疼等痰熱證。黃連、黃柏均有清熱燥濕、瀉火解毒功效，其主要活性成分為鹽酸小檗堿等多種生物堿，具有抗病毒、抗菌消炎、降血壓、降血糖、降低血清膽固醇、抗癌、抗心律失常、升白細胞、清熱解毒、利膽等生理活性［1］。為更有效控制喉蛾散的質量，確保患者用藥安全有效可控，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法對喉蛾散中黃連、黃柏所含活性成分鹽酸小檗堿進行含量測定。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器，Empower色譜工作站（美國Waters公司）；TU-1900型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；ME104E型電子天平（精度為萬分之一），XP26型電子天平（精度為百萬分之一），均購自梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司；KQ-300DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201212，純度為86.7%，中國食品藥品檢定研究院）；喉蛾散（醫院制劑，批號分別為 20190601，20190602，20190701）；乙腈為色譜純（美國Merk公司，批號為JB085530）；磷酸為色譜純（美國Fisher公司，批號為190900）；甲醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20190910）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters Xridge RShield RP18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈（A）-0.05% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，詳見表 1；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm；流速：1 mL ／min；進樣量：5 μL。在此色譜條件下，理論板數按鹽酸小檗堿峰計大于11 000。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.2 溶液制備［2-3］

對照品溶液：取鹽酸小檗堿7.18 mg，精密稱定，加70%乙醇溶解并定容至50 mL，制成每1 mL含鹽酸小檗堿143.60 μg的對照品母液。

供試品溶液：取樣品（批號為 20190602）0.2 g，精密稱定，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率為 250 W，頻率為 40 kHz）30 min，取出，放涼，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按喉蛾散處方和工藝制備缺黃連、黃柏陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察［4］

專屬性試驗：取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對照品相應保留時間處有吸收峰，而缺黃連、黃柏的陰性對照品溶液在對應保留時間處無吸收峰出現，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：分別精密吸取對照品母液1，3，5，7 mL，置 20，10，10，10 mL 容量瓶中，并分別用 70%乙醇溶劑并定容，搖勻，連同母液得系列對照品溶液，分別精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，以對照品質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝20 575X-2 715.7，R2＝0.999 9（n＝5）。結果表明，鹽酸小檗堿質量濃度在 7.18 ～143.60 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液（71.80 μg ／mL）5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，連續進樣6次，計算其峰面積的相對標準偏差。結果的RSD為2.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20190602）樣品6份，依法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果鹽酸小檗堿的平均含量為0.88%，RSD為 1.87%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，12，24h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果的RSD為2.61%（n＝6），表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20190602，鹽酸小檗堿的含量為0.874%）6份，每份0.2 g，精密稱定，分別精密加入適量鹽酸小檗堿對照品，依法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 鹽酸小檗堿加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為20190601，20190602，20190701），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，用外標法計算喉蛾散中鹽酸小檗堿的含量。結果見表3。

表3 3批樣品中鹽酸小檗堿含量測定結果（n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇［5-6］

為盡可能多地采集到豐富的物質成分信息，參考2015年版《中國藥典（一部）》中黃連的鹽酸小檗堿、黃柏的鹽酸小檗堿，甘草的甘草苷、甘草酸，苦參的苦參堿、氧化苦參堿等指標成分的檢測波長，曾分別于230，265，340nm波長處進行預試驗，結果甘草苷、甘草酸峰高較低，分離度差，基線噪音影響大，定量不準確。鹽酸小檗堿峰高相對較高，樣品干擾少，分離度好，且基線平穩，適合作為含量測定指標成分，故選擇鹽酸小檗堿最大吸收波長265 nm作為喉蛾散中鹽酸小檗堿含量測定的紫外檢測波長。

3.2 流動相選擇［7-10］

曾選擇乙腈-1.5%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇-水等流動相系統進行預試驗，結果顯示，采用乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相梯度洗脫，供試品溶液中鹽酸小檗堿與其他峰分離較好，故選其作為流動相。

3.3 提取溶劑選擇［11-12］

在原供試品溶液制備方法基礎上考察了不同提取溶劑（70%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水）對含量測定指標成分的影響，以水為溶劑進行提取時，鹽酸小檗堿的含量明顯降低，70%甲醇和70%乙醇的差異不大，因甲醇具有中樞神經系統毒性，故選用乙醇體系的溶劑。分別對不同比例的乙醇提取溶劑進行比較，發現70%乙醇為提取溶劑時得到的鹽酸小檗堿的含量最高，故最終選擇70%乙醇為提取溶劑。