香芍散結口服液質量標準研究*

歐陽冰，王顯鳳，宋宏宇，龍世林，王林麗

（中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院藥劑科，重慶 400042）

香芍散結口服液是中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院藥劑科王林麗主任中藥師根據中醫理論，經多年基礎科研和臨床實踐研制而成的中藥制劑，為我院非標準中藥制劑［1］，由香附、當歸、丹參、白芍等中藥組方，具有疏肝解郁、養血柔肝、活血化瘀、理氣止痛、清熱散結等功效，對乳腺增生癥、男性乳腺發育癥有明顯療效。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中白芍、當歸、丹參、香附進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定方中白芍主要活性成分芍藥苷的含量，以控制該制劑的質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Sartorius BT25S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-50B型超聲波清洗儀（昆明市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；雙槽層析缸；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，規格為100 mm×200 mm）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為110736-201438，含量為96.4% ），阿魏酸對照品（批號為 110773-201313），當歸對照藥材（批號為120927-201014），原兒茶醛（批號為 110810-201007），α-香附酮（批號為 110748-201513），均購自中國食品藥品檢定研究院；香芍散結口服液（醫院制劑，批號分別為 170104，170224，170324）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

白芍：取樣品20 mL，分別用20 mL水飽和正丁醇提取3次，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加2 mL乙醇溶解，作為供試品溶液。再取缺白芍的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取芍藥苷對照品，精密稱定，用甲醇制成質量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水（40∶5∶10∶0.2，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖

丹參：取樣品30 mL，分別用25 mL乙醚萃取2次，合并提取液，水浴蒸干，用無水乙醇1 mL溶解殘渣，作為供試品溶液。再取缺丹參的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取原兒茶醛對照品，精密稱定，加乙醇制成質量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一羧甲基纖維素鈉硅膠G薄層板上，以二氯甲烷 -甲醇 -無水甲酸（10∶0.8∶0.2，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2% 間苯三酚無水乙醇硫酸（1∶1）混合溶液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

當歸：取樣品10 mL，加20 mL水飽和乙酸乙酯處理，提取液水浴蒸干，殘渣用無水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。再取缺當歸的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取阿魏酸對照品，精密稱定，加乙醇制成質量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷 -乙酸乙酯 -甲酸（2∶1∶0.5，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

香附：取樣品20 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲30 min，濾過，水浴蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。再取缺香附的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取α-香附酮對照品，精密稱定，用乙酸乙酯制成質量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶2∶2∶0.1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同的黃色斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1%磷酸溶液（15 ∶85，V／V）；柱溫：室溫；流速：1 mL ／min；進樣量：10 mL；檢測波長：230 nm。

2.2.2 溶液制備

取干燥至恒重的芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容至50mL容量瓶中，制成質量濃度為50μg／mL的對照品溶液。精密吸取5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇30 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，取續濾液作為供試品溶液。按處方組成精密量取缺白芍藥材的香芍散結口服液陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

空白干擾試驗：取2.2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進樣檢測，對照品芍藥苷溶液色譜的保留時間約5 min，供試品溶液色譜中的芍藥苷與其他成分達基線分離，分離較好，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

線性關系考察：取芍藥苷對照品24.94 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，即得質量濃度為0.249 4 mg／mL的芍藥苷貯備溶液，精密吸取上述貯備溶液適量，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成7個不同質量濃度的梯度對照品溶液（0.007482，0.024 94，0.049 98，0.074 82，0.099 76，0.149 64，0.249 40 mg／mL），依次測定。以質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝40 485X＋80.775，R2＝0.998 3（n＝7）。結果表明，芍藥苷質量濃度在 0.007 482～0.249 4 mg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件重復進樣6次。結果峰面積的RSD為0.72%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為170104），分別于 0，1，2，4，8，12 h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結果峰面積的RSD為0.49%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

圖2 高效液相色譜圖

重復性試驗：取樣品（批號為170104）5份，依法平行制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進樣測定樣品中芍藥苷的平均含量。結果平均含量為0.62 mg／mL，峰面積的RSD為1.17%（n＝5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為170104）2.5 mL，置 50 mL 容量瓶中，按低、中、高濃度分別精密加入芍藥苷對照品溶液（0.249 4 mg ／mL）5.6，9.3，13.0 mL，依法平行制備 3份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗結果（n＝9）

定量限測定：取芍藥苷對照品溶液（0.007482 mg／mL）適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制備成不同質量濃度的梯度對照品溶液，依法進樣測定，取芍藥苷信噪比（S／N）為10∶1時的質量濃度作為定量限，結果為 0.194 1 μg ／mL。

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，每批3份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算香芍散結口服液中芍藥苷的含量。結果見表2。

3 討論

香芍散結口服液是臨床驗方，療效確切，但缺乏內在質量控制方法，制劑質量穩定性難以保障，可能會影響其臨床療效的穩定。該制劑含14味中藥，成分復雜，干擾多，給質量控制方法的建立帶來一定困難。選取方中的主藥香附、當歸、丹參、白芍進行TLC鑒別，通過系統的樣品預處理，展開劑優化，并均做陰性對照試驗。結果表明，各藥材的主要薄層斑點均不受其他藥材干擾，經方法學考察驗證，表明該方法專屬性強，重復性好，可用于方中主要藥材香附、當歸、丹參、白芍的定性鑒別。

表2 3批樣品中芍藥苷含量測定結果（n＝3）

白芍是香芍散結口服液中的主藥，而芍藥苷是白芍主要活性成分，藥理作用多樣，具有抗炎、鎮痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗抑郁和抗肝纖維化等功效，對自身免疫性疾病、心腦血管疾病和神經退行性疾病也能起到改善和治療作用［2-5］，是香芍散結口服液發揮疏肝解郁、理氣止痛等功效的重要物質基礎，故選擇芍藥苷作為香芍散結口服液質量控制定量指標成分。通過樣品預處理、色譜柱選擇和流動相優化等建立了該制劑中芍藥苷的定量分析方法。查閱文獻［6-15］，本研究中建立的方法在柱效和分離度方面均得到了優化，簡便快捷，準確度較高，可為香芍散結口服液質量標準的提升奠定基礎。