一測多評法測定參芪扶正注射液中苯丙素苷類和核苷類成分含量

何昌雄

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院，福建 福州 350000）

參芪扶正注射液是由黨參和黃芪組方，2味中藥材經水提取后與注射用氯化鈉配制而成，具有益氣扶正功效，用于肺脾氣虛引起的神疲乏力、少氣懶言、自汗眩暈，肺癌、胃癌見上述證候者的輔助治療［1］。其含有苯丙素苷類、核苷類、皂苷類、糖類等活性成分，苯丙素苷類和核苷類成分有較好的免疫調節作用，在抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等方面有較好的藥理作用［2-4］。參考文獻［5-7］，考慮到多指標質量控制需要的對照品種類和量較大，本研究中以參芪扶正注射液中的黨參苷Ⅰ和鳥苷為內標物，分別建立2種成分與黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、尿苷、腺苷間的相對校正因子，采用一測多評法（QAMS）同時測定參芪扶正注射液中8種成分的含量。QAMS法是在多指標質量控制時，以藥材中易得、價廉、穩定的對照品的典型有效成分為內標物，建立該有效成分與其他成分間的相對校正因子，再通過校正因子計算出其他成分的含量。在方法實施時，可在只有1個對照品而其余對照品不足的情況下，可實現多種組分的同步含量測定，彌補了中藥制劑含量測定過程中需要對照品品種多且不易獲得的缺陷，已廣泛應用于多種藥物活性成分的定量測定［8-9］。本研究中考察了所建立的相對校正因子在不同儀器及不同試驗條件下的重現性；采用相對保留時間定位法對各待測成分色譜峰進行定位；用t檢驗比較QAMS法和高效液相色譜（HPLC）外標（ESM）法測定的結果，對將QAMS應用于參芪扶正注射液多組分的含量測定進行了較全面的考察?，F報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters 2695型高效液相色譜儀，包括2695 Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自動進樣器、Empower 3色譜工作站、2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；1260 Infinity型高效液相色譜儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動進樣器、Agilent EZchrom色譜工作站、G4212B二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；AUW-220D型電子天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；Milli-Q Academic超純水系統（美國默克密理博公司）。

色譜柱：ShimadzuVP-ODSC18液相色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；Waters Sunfire ODS C18液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；Agilent Zorbax-C18液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；Hypersil ODS C18液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。

試藥：參芪扶正注射液（麗珠集團利民制藥廠，批號分別為 1802115 ／1，1803222 ／2，1804105 ／1，1805261 ／2，1806162 ／1，1809052 ／2，規格為每瓶 250 mL）；黨參苷Ⅰ對照品（批號為6257-45，含量為98%），黨參苷Ⅱ對照品（批號為6257-73，含量為96.8%），黨參苷Ⅳ對照品（批號為 6257-82，含量為 97.6% ），丁香苷對照品（批號為 5124-11，含量為98.2%），胞苷對照品（批號為MUST-20151212，含量為 98.5%），均購自四川省成都曼思特公司；尿苷對照品（批號為110887-201803，含量為 99.5%，4℃冷藏保存），腺苷對照品（批號為110879-201703，含量為 99.7% ，4 ℃冷藏保存），鳥苷對照品（批號為 111977-201501，含量為 93.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（美國Merk公司，批號分別為1910318，191117）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

混合對照品溶液：取黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷 0.2156，0.1707，0.155 8，0.100 3 mg 的對照品混合溶液，即得苯丙素苷類成分混合對照品溶液。取胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷對照品適量，精密稱定，分別加純凈水制成每1 mL含胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷 0.090 4，0.148 6，0.118 4，0.120 3 mg的對照品混合溶液，即得核苷類成分混合對照品溶液。

供試品溶液：精密量取樣品50 mL，置200 mL棕色容量瓶中，加甲醇約120 mL，密塞，置冰箱（2～10℃）中浸漬過夜。精密量取樣品參芪扶正注射液25 mL，加在活化過的大孔樹脂上，用30%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加流動相使溶解，轉移至10 mL棕色容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得苯丙素苷類成分供試品溶液。避光操作。精密量取樣品50 mL，置200 mL容量瓶中，加純凈水約120 mL，密塞，超聲處理（功率為500 W，頻率為 40 kHz）40 min，放冷，加純凈水定容，經 0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得核苷類成分供試品溶液。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件［10-13］與系統適用性試驗

苯丙素苷類成分：色譜柱為Agilent Zorbax-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈 -0.3% 甲酸溶液（39 ∶61，V／V）；流速為 1.0 mL ／min；UV 檢測器檢測波長為268 nm；柱溫為35℃。

核苷類成分：色譜柱為Agilent Zorbax-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇 -水（65 ∶35，V／V）；流速為 1.0 mL／min；UV檢測器檢測波長為260 nm；柱溫為35℃。

取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 方法學考察

線性關系考察：精密量取苯丙素苷類及核苷類成分混合對照品溶液 0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇及純凈水逐步稀釋，定容，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進樣 10 μL，記錄色譜圖。以對照品質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得各組分回歸方程及線性范圍。結果表明，各成分在各自線性范圍內與峰面

積線性關系良好。取峰面積的信噪比（S／N）為10倍時的對照品質量濃度為定量限（LOQ）。結果見表1。

表1 各成分線性關系和定量限考察結果（n＝6）

精密度試驗：精密吸取苯丙素苷類和核苷類成分混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜峰峰面積。結果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷峰面積的RSD分 別 為 0.91% ，0.65% ，0.73% ，0.82% 和1.01%，0.54%，0.91% ，0.72% （n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為1806162／1），依法制備供試品溶液，分別于 0，3，6，9，12，20，24 h 時進樣 10 μL，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積。結果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷峰面積的RSD分別為 1.03%，1.22%，1.13%，0.94%和 0.85%，0.91%，1.12%，1.04%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為1806162／1），依法平行制備6份供試品溶液，每份精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.96% ，0.73% ，0.62% ，0.51% 和 0.75% ，0.64% ，0.93%，0.87%（n＝6），表明方法重復性較好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為1806162／1）6份，每份 25 mL，分別精密加入黨參苷Ⅰ（0.215 6 mg／mL）、黨參苷Ⅱ（0.170 7 mg／mL）、黨參苷Ⅳ（0.155 8 mg／mL）、丁香苷（0.100 3 mg ／mL）混合對照品溶液各 2.0，2.5，3.0 mL，依法制備苯丙素苷類成分供試品溶液，精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件測定，計算加樣回收率。結果見表2。精密量取已知含量的樣品（批號為 1806162／1）6 份，每份 25 mL，分別精密加入胞苷 （0.215 6 mg／mL）、鳥 苷 （0.215 6 mg／mL）、尿 苷（0.215 6 mg ／mL）、腺苷（0.215 6 mg ／mL）混合對照品溶液各 1.5，2.0，2.5 mL，依法制備核苷類成分供試品溶液，精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件測定，計算加樣回收率。結果見表3。

表2 4種苯丙素苷類成分加樣回收試驗結果（n＝6）

2.3 校正因子重現性考察及各組分色譜峰定位

校正因子的計算：以黨參苷Ⅰ和鳥苷為內標物，在2個不同的實驗室分別對黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、尿苷、腺苷的校正因子按公式 ［fk／w＝fk／fw＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）］計算，式中Ak為內標物峰面積，Wk為內標物濃度；Am為其他組分峰面積，Wm為其他組分濃度）進行復核計算。結果表明，2個實驗室間的差異不明顯（RSD＜0.50%）。詳見表 4。

不同儀器及色譜柱的影響：考察了不同儀器和不同色譜柱對相對校對因子的影響，結果表明，所得相對校正因子差異不明顯（RSD＜0.60%）。詳見表5。

不同柱溫的影響：在不同的實驗室，采用Waters 2695型高效液相色譜系統、Agilent Zorbax-C18色譜柱進行試驗，分別考察不同柱溫對相對校正因子的影響，結果表明，柱溫對相對校正因子的影響不顯著（RSD＜0.50%）。詳見表6。

不同流速的影響：在同一實驗室，采用Waters 2695型高效液相色譜系統、Agilent Zorbax-C18色譜柱進行試驗，分別考察不同流速對相對校正因子的影響，結果表明，流速對相對校正因子的影響不顯著（RSD＜0.50%）。詳見表7。

表3 4種核苷類成分加樣回收試驗結果（n＝6）

待測組分色譜峰定位：查閱文獻［14-15］，相對保留時間定位法優于保留時間差定位法，本試驗中分別考察了采用不同色譜儀及色譜柱時，黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷色譜峰與黨參苷Ⅰ色譜峰的相對保留時間及胞苷、尿苷、腺苷色譜峰與鳥苷色譜峰的相對保留時間。結果表明，不同色譜儀及色譜柱所測得的各組分相對保留時間無顯著差異（RSD＜0.50%）。詳見表8。

表4 苯丙素苷類與核苷類成分在不同實驗室測得的相對校正因子

2.4 QAMS法與ESM法測定結果的比較

采用QAMS法和ESM法測定6批樣品（批號分別為1802115／1，1803222／2，1804105／1，1805261／2，1806162／1，1809052／2）含量。依法制備苯丙素苷類和核苷類成分供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，分別采用ESM法和QAMS法計算參芪扶正注射液中各成分的含量，并對測定結果行t檢驗。結果表明，2種方法無顯著差異，詳見表9。

表5 不同儀器及色譜柱相對校正因子耐用性考察結果

表6 不同柱溫相對校正因子耐用性考察結果

3 討論

3.1 色譜條件選擇

檢測波長確定：本試驗中在190～400 nm波長段分別掃描8種活性成分對照品溶液，結果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷4種苯丙素苷類成分的最大吸收波長為268 nm，胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷4種核苷類成分的最大吸收波長為260 nm，為保證各成分都具有適宜的靈敏度和精密度，試驗中采用2套光譜檢測波長，保證均在最佳吸收波長處檢測8種成分。

流動相選擇：根據待測組分理化性質和結構的差異，本試驗中分別采用2組流動相進行分離。由于核苷類成分（胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷）極性大，易溶于水，故采用甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等度洗脫，各色譜峰均可被檢出，與相鄰色譜峰分離效果較好，考慮乙腈較甲醇毒性大，易污染環境，且價格高，故選擇甲醇-水溶液等度洗脫作為本試驗的流動相檢測核苷類成分。為使黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷4種苯丙素苷類成分得到良好分離，采用乙腈-0.3%甲酸溶液（39∶61，V／V）等度洗脫，優化洗脫條件，實現同時檢測出4種活性成分，該色譜條件下系統適用性均符合要求。

表7 不同流速相對校正因子耐用性考察結果

表8 不同色譜儀及色譜柱相對保留時間比較

3.2 QAMS法內標物選擇

黨參苷Ⅰ和鳥苷在參芪扶正注射液中含量較高，性質穩定，便宜，易得，是實驗室常用對照品，符合QAMS法對參照物的要求，故分別以黨參苷Ⅰ和鳥苷作為內標物，經上述方法學考察，方法切實可行。

3.3 相對校正因子的重現性

考察了不同儀器、色譜柱、柱溫及流速對相對校正因子的影響，結果表明，各校正因子在以上不同條件下重現性均良好，QAMS法用于分析樣品中各成分的通用性較好，可在不同實驗室條件下進行含量檢測。

3.4 QAMS法色譜峰定位

中藥成分復雜，在不同色譜系統中會出現不同的色譜峰，在同一色譜系統中，其色譜峰的出峰時間、數量等也會受到色譜柱、柱溫等諸多因素的影響，因此待測成分色譜峰的定位至關重要。本試驗中考察相對保留時間參數在不同品牌HPLC儀和不同品牌色譜柱中的重現性。結果表明，相對保留時間在不同色譜系統及色譜柱條件下波動相對較小，且重現性較好（RSD＜0.50%）。

3.5 方法評價

本研究中建立了測定參芪扶正注射液中苯丙素苷類成分（黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷）和核苷類成分（胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷）的有效成分含量的QAMS法，該方法結果準確、簡便有效、重現性高，可用于參芪扶正注射液中有效成分的含量測定。

表9 外標法與一測多評法測定8種有效成分含量結果（n＝6，μg／mL）