基于網絡藥理學探討白花蛇舌草治療口腔癌的作用機制*

顧 磊 ，廖 維 ，周建萍

（1.武警重慶市消防總隊醫院口腔科，重慶 401120； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院麻醉科，重慶 400037； 3.重慶醫科大學附屬口腔醫院，重慶 401147）

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤，也是導致患者死亡的重要原因［1］，具有高發病率、高致死率的特點［2-3］，臨床多采用手術切除、放射線治療、化學治療、中藥治療等方式治療。中醫學認為，癌癥多由熱、毒、痰、瘀及體虛等因素誘發［4］，中藥以其療效確切、應用廣泛、不良反應小等優點，受到臨床醫師和科研人員的廣泛關注［5］。白花蛇舌草Oldenlandia diffusa屬茜草科植物，為臨床治療癌癥的常用藥物之一［6］，廣泛用于治療結直腸癌［7］、白血?。?］、肝癌［9］、肺癌［10］、卵巢癌［11］、乳腺癌［12］等。TING 等［9］對臺灣地區中草藥處方頻度進行橫斷面分析發現，白花蛇舌草治療肝癌具有顯著療效。此外，白花蛇舌草具有抗增殖［13］、促凋亡［11，14-15］抗炎［16-17］、抗氧化［18］、抗血管生成［19］、調節免疫功能［16，20-23］等多種抗癌作用機制；其提取物可通過激活p53誘導細胞凋亡，從而抑制癌細胞的生長［13］，還可增強巨噬細胞功能，從而抑制小鼠腎癌細胞生長。鑒于白花蛇舌草在抗腫瘤治療中的廣泛應用及其良好的臨床療效，本研究中采用網絡藥理學方法整體、系統地闡述藥物、靶點和疾病間的關系［24-25］，直觀地呈現藥物靶點網絡［26］，探討了白花蛇舌草治療口腔癌的作用機制及其藥用價值，為白花蛇舌草治療口腔癌藥效機制的定位和產生協同作用的潛在蛋白靶點的確定提供新的研究方法?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據集構建

數據集收集：檢索 HIT（http：／／lifecenter.biosino.org／hit／）［27］、中藥綜合資源數據庫（TCMID，http：／／www.megabionet.org／tcmid ／）［28］數據庫，PubMed 數據庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／）［29］和中藥系統藥理數據庫和分析平合（TCMSP）數據庫（http：／／lsp.nwu.edu.cn ／）［30］，從生物醫學文獻中收集白花蛇舌草的化合物成分，構建白花蛇舌草化合物數據集。

化合物篩選：根據毒藥物動力學（ADME）藥物篩選標準，口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）＞ -0.3，可旋轉鍵數目（RBN）≤10，分子極性表面積（PSA）≤60，對化合物進行初篩，剔除重復出現的化合物成分。進一步運用PubChem數據庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）查詢獲得化合物的化學結構式［31］，基于化學結構式，運用TargetNet數據庫（http：／／targetnet.scbdd.com）［32］，根據里賓斯基五規則對化合物的成藥性進行評分。

1.2 靶點預測

通過搜索TCMSP數據庫中白花蛇舌草化合物的名稱，獲得其對應的靶蛋白信息；在基于當前化學基因組學數據構建大量的QSAR模型來預測化合物靶點的TargetNet數據庫中檢索，并篩選 Prob≥0.9 的靶點［32］。運 用 Pharmmapper 數 據 庫 （http：／／lilab-ecust.edu.cn ／Pharmmapper／）［33］，通過反向藥效團映射方法識別小分子的潛在靶點。

1.3 靶點收集及蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡建立

采用 DiseaseGene Network 數據庫（http：／／www.disgenet.org ／）［34］和 DrugBank 數 據 庫 （https：／／www.drugbank.ca ／）［35］，搜索與“Oral Cavity Carcinoma”相關的疾病靶點，采用GeneMANIA數據庫（http：／／genemania.org ／）［36］建立與已獲取疾病靶點關聯性較強的靶點?；谑占目谇话┫嚓P靶點，采用STRING數據庫（https：／／string-db.org ／）［37］建立 PPI網絡，作為基因映射的背景網絡。

1.4 預測靶點的基因映射提取及PPI網絡建立

采用Cytoscape軟件將白花蛇舌草化合物的靶點映射在口腔癌疾病靶點的PPI背景網絡上，提取白花蛇舌草治療口腔癌的預測靶點，并將其在STRING數據庫建立PPI網絡［37］，進一步研究具有高置信度（＞ 0.7）的 PPI。

1.5 拓撲分析與富集分析

拓撲分析：采用Cytoscape軟件，對獲取的上述相關靶點，計算“Degree”“ClosenessCentrality”“Betweenness Centrality”3個拓撲性質，選取3個指標均大于中位數的靶點［38］，篩選出具有拓撲重要性的Hub節點，將其定義為白花蛇舌草治療口腔癌的核心靶點。

富集分析：采用 DAVID 數據庫（https：／／david.ncifcrf.gov ／）［39］對生物過程（BP）、細胞成分（CC），分子功能（MF）及作用通路進行富集分析。P＜0.05為白花蛇舌草治療口腔癌的相關作用通路；P＜0.01和FDR＜1為白花蛇舌草治療口腔癌的核心作用通路。

基于收集獲得的白花蛇舌草治療口腔癌的預測靶點，采用 KEGG 數據庫（http：／／www.kegg.jp ／）［40］搜索并建立核心通路的路線圖，標注通路內的預測作用靶點。

1.6 “靶點-通路”網絡建立

基于收集獲得的預測靶點及富集分析核心作用通路，采用Cytoscape軟件建立白花蛇舌草治療口腔癌的“靶點-通路”網絡。

2 結果

2.1 數據集構建及靶點預測

通過 HIT，TCMID，PubMed，TCMSP 數據庫，共獲得93種白花蛇舌草化學成分，根據ADME藥物篩選標準及里賓斯基五規則，共篩選出32種具有良好成藥性的化學成分。基于此，采用3種方法預測白花蛇舌草的靶點信息，獲得1 468個靶點信息，刪除不同化合物間的重復靶點，共獲得353個白花蛇舌草的預測靶點。

2.2 口腔癌疾病相關靶點及PPI網絡的建立

檢索DiseaseGene Network和DrugBank數據庫，共收集獲得281個口腔癌的預測靶點，采用STRING數據庫建立口腔癌的PPI網絡，獲得1個具有281個節點、4 096條邊的PPI網絡。詳見圖1。

2.3 基因映射結果與拓撲分析結果

基因映射：采用Cytoscape軟件，將353個白花蛇舌草預測靶點映射在以口腔癌PPI網絡為背景的網絡上，共獲得200個預測靶點，占口腔癌疾病靶點的71.17% 。詳見圖 2。

拓撲分析：白花蛇舌草治療口腔癌的200個預測靶點中，“Degree”中位數為 23，“Closeness Centrality”中位數為 0.476 534 985，“Betweenness Centrality”中位數為0.002 067 075，其中，“Degree”“Closeness Centrality”“Betweenness Centrality均大于中位數，且具有重要拓撲意義的節點共75個，即為Hub節點，為白花蛇舌草治療口腔癌的核心靶點。

圖1 口腔癌281個靶點的PPI網絡

圖2 基因映射提取白花蛇舌草治療口腔癌的預測靶點

2.4 預測靶點的PPI網絡建立、富集分析結果及“靶點-通路”網絡建立

基于已獲得的200個白花蛇舌草治療口腔癌的預測靶點信息，建立PPI網絡，得1個具有200個節點、2 604條邊的PPI網絡，選擇高置信度PPI，得1個具有200個節點、1 204條邊的PPI網絡，詳見圖3。對預測靶點信息進行富集分析，P＜0.05時包括336個 BP、38個 CC、105個 MF、25條相關作用通路，P＜0.01及FDR ＜0.01時包括 51個 BP、7個 CC、31個 MF、4條核心作用通路。基于此，構建白花蛇舌草治療口腔癌的“靶點-通路”網絡圖，詳見圖4。基于在KEGG建立的4個核心作用通路的可視化通路網絡圖，建立白花蛇舌草治療口腔癌的可視化通路網絡圖，詳見圖5。

圖3 白花蛇舌草治療口腔癌的預測靶點高置信度PPI網絡

圖4 白花蛇舌草治療口腔癌“靶點-通路”網絡圖

3 討論

本研究中，根據里賓斯基五規則和ADME參數［30，32］篩選出白花蛇舌草中32種具有良好成藥性的不同化合物成分，根據這些化合物成分，采用TCMSP，TargetNet，Pharmmapper數據庫檢索，收集到353個白花蛇舌草靶點，結合在DiseaseGene Network及DrugBank數據庫收集的281個口腔癌相關靶點，通過基因映射獲得了白花蛇舌草治療口腔癌的200個預測靶點，由此建立了一個具有200個節點、1 204條邊的高置信度PPI網絡，通過拓撲分析，獲得了白花蛇舌草治療口腔癌的75個核心靶點。

富集分析結果顯示，白花蛇舌草治療口腔癌主要作用于胞漿、核質、細胞器膜、質膜、細胞核等7個細胞成分，涉及了包括凋亡、增殖、炎性反應、氧化應激等51個生物過程及31個分子功能，這與已有的體內外實驗研究結果一致［13-16］，其還參與如類固醇、單萜類、雜環類等多種物質的生物代謝過程，這些代謝過程也一定程度上促進了白花蛇舌草的抗癌作用，LIEW等［41］研究發現，單萜吲哚生物堿具有顯著的細胞生長抑制作用，且對癌細胞具有靶向選擇性。通路富集分析結果表明，HIF-1 signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Estrogen signaling pathway，TNF signaling pathway為核心作用通路。HIF-1 signaling pathway可通過調節細胞凋亡、炎癥、氧化應激及細胞周期等發揮抗癌作用。有研究發現，HIF-1通路的激活可誘導癌細胞線粒體解偶聯從而發揮抗癌作用，核心靶點HIF-1被認為具有廣泛前景的抗腫瘤藥物靶點［42］。ALBADARI等［43］研究認為，HIF-1／2抑制劑及HIFs調節的廣泛復雜性有利于開發更精確的抗癌治療方法。Prolactin signaling pathway及Estrogen signaling pathway被認為是參與乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的經典作用通路［44-45］。YAMAGUCHI等［46］研究發現，阻斷 Estrogen signaling pathway 可顯著降低芳香化酶基因表達，從而抑制癌細胞的生長，這2條通路與 p53 signaling pathway，PI3K signaling pathway，MAPK signaling pathway等多條通路間存在復雜的交互作用，從而發揮抗腫瘤作用［47-49］。TNF signaling pathway在腫瘤相關研究中一直是被關注的焦點，ROBAYE等［50］及TARTAGLIA等［51］研究發現，TNFR1可觸發腫瘤內皮細胞凋亡機制。MONTFORT等［52］研究發現，在腫瘤細胞中輸送高濃度的腫瘤壞死因子能顯著提高免疫治療效果，TNF signaling pathway不僅是與炎癥、凋亡密切相關的信號通路，與PI3K-Akt signaling pathway間的交叉作用還參與細胞周期調節［53］。WANG 等［54］研究發現，通過 TNF-α ／NF-κB 與 PI3K／AKT signaling pathway逆轉EMT可抑制癌細胞的侵襲與遷移。

圖5 白花蛇舌草治療口腔癌的可視化通路網絡圖

綜上所述，本研究中通過網絡藥理學的方法建立了白花蛇舌草治療口腔癌的可視化“靶點-通路”網絡圖及作用機制圖，并明確了白花蛇舌草治療口腔癌的多通路、多靶點的作用機制，白花蛇舌草治療口腔癌藥效機制的定位和協同作用的潛在蛋白靶點與通路。