納洛酮腹腔注射對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的改善作用

李小亮，李林，孫林林，李君，陳揚，付愛軍

1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2鄭州市第七人民醫(yī)院；3開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院

各種原因引起腦底部或腦表面血管發(fā)生病理性改變，導(dǎo)致血管壁損傷并破裂，血液進入蛛網(wǎng)膜下腔而引起一系列臨床綜合征，此種綜合征在臨床上被稱為蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。SAH是一種比較嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在腦血管疾病中，占比約為10%，具有較高的致殘率及病死率[2]。近期研究結(jié)果顯示，自噬在SAH后腦組織細(xì)胞損傷的一系列病理生理機制中具有重要作用，能夠增強細(xì)胞對損傷性刺激的耐受能力進而穩(wěn)定細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。臨床研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，阿片類受體拮抗劑納洛酮注射液具有一定的神經(jīng)保護作用及神經(jīng)營養(yǎng)功效，但對SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響尚不明確。2016年10月～2019年2月,本實驗通過血管內(nèi)穿刺法制作SAH模型，并給予納洛酮注射液干預(yù)，觀察納洛酮注射液對SAH大鼠行為學(xué)變化及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達的影響，探討納洛酮注射液對腦組織保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 清潔級SD雄性大鼠36只，周齡9～12周，體質(zhì)量300～400(236.21±4.75)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號SCXK(京)2014-0004)。飼養(yǎng)溫度在19～25 ℃、濕度55%～65%的環(huán)境下，保證日常光照10～12 h，噪音<60 dB，定期清洗并消毒鼠籠，對大鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。 藥品與試劑：納洛酮(四川青木制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20113359)，兔抗Beclin-1多克隆抗體和兔抗LC3-Ⅱ多克隆抗體(日本株式會社)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。儀器：TP-1型攤片機、820-Ⅱ型切片機(德國Leica公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，圖像采集及分析系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 大鼠分組、SAH模型建立及納洛酮給藥方法 36只實驗大鼠隨機等分為納洛酮組、SAH組、假手術(shù)組。稱重后，以0.3 mL/100 g的標(biāo)準(zhǔn)計算10%水合氯醛用量，采用腹腔內(nèi)注射的給藥方式進行麻醉。待大鼠對刺激無反應(yīng)后，取仰臥位，將門齒及四肢固定于操作臺。納洛酮組、SAH組參照文獻[4]的頸內(nèi)動脈穿刺法建立SAH模型，頸部備皮后，消毒貼膜，沿正中縱行切開頸部皮膚，作皮下組織鈍性分離，分離頸部神經(jīng)血管，結(jié)扎并剪斷頸外動脈，纖芯自頸外動脈近端穿入，并經(jīng)頸內(nèi)動脈穿入顱內(nèi)刺破血管，造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，建模成功后，拔出纖芯，碘伏棉球進行消毒，并于造模完成后將大鼠正常飼養(yǎng)。假手術(shù)組按上述步驟進行操作，但不刺破血管。納洛酮組造模成功后立即腹腔注射納洛酮注射液(150 mg/kg)，每12 h重復(fù)1次，SAH組及假手術(shù)組給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.3 各組學(xué)習(xí)記憶能力觀察 采用穿梭箱實驗。實驗大鼠于造模前2 d開始進行穿梭箱練習(xí)，2次/d，建立大鼠的條件反射。造模成功后24 h行穿梭箱實驗，首先環(huán)境熟悉5 min，然后予聲光刺激5 s，接著電擊20 s(1.5 mA),完成一次實驗。兩次實驗之間休息20 s，共計30次。記錄大鼠逃到安全區(qū)的時間和逃到安全區(qū)的次數(shù)。

1.4 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色。穿梭箱實驗后，各組隨機選出6只大鼠，麻醉后4%多聚甲醛灌注，剝離出大鼠腦組織并固定3 d。石蠟包埋后切取帶海馬CA1區(qū)的切片(5 μm)，60 ℃恒溫烤箱過夜處理，取出切片后放于二甲苯中進行脫蠟，乙醇脫水，蘇木素浸泡1 min，流動水沖洗后1%鹽酸乙醇分化，流動水沖洗，1%伊紅染液處理2 min，乙醇梯度脫水5 min，二甲苯透明5 min，取出切片后，顯微鏡下觀察染色滿意，滴入中性樹膠，蓋玻片封閉。每塊腦組織取6張切片進行HE染色。顯微鏡(×400)下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)，Motic-6.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計正常形態(tài)及結(jié)構(gòu)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

1.5 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法。石蠟切片，60 ℃烤箱過夜，脫蠟、水化，高壓修復(fù)120 s，PBS緩沖液沖洗。取6張切片滴加Beclin-1抗體(1∶150)，另取6張切片滴加LC3-Ⅱ抗體(1∶150)，4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌，加入組化二抗，37 ℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察神經(jīng)細(xì)胞，隨機選取3個不同視野采集圖片，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

1.6 各組海馬組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白檢測 采用Western blotting法。取每組剩余的6只大鼠，斷頭后即刻冰上剝離海馬組織，RIPA裂解研磨好的海馬組織，高速低溫離心后提取上清液，BAC法測定蛋白濃度。依次進行電泳、濕法轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶抗原封閉，滴加Beclin-1一抗(1∶1 000)、LC3-Ⅱ一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱振蕩過夜，洗膜，加入二抗，再次洗膜，滴加顯影液，凝膠成像分析系統(tǒng)發(fā)光顯影。以β-actin作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件對結(jié)果進行分析，計算Beclin-1、LC3-Ⅱ的相對灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組逃到安全區(qū)時間、逃到安全區(qū)次數(shù)比較 假手術(shù)組大鼠行為學(xué)功能(學(xué)習(xí)記憶能力)良好，面對聲光及電流刺激具有較好的應(yīng)對能力，能夠以較短的時間及較多次數(shù)躲避到安全環(huán)境中。與假手術(shù)組比較，SAH組逃到安全區(qū)時間延長、逃到安全區(qū)次數(shù)減少(P均<0.05)；與SAH組比較，納洛酮組逃到安全區(qū)時間縮短、逃到安全區(qū)次數(shù)增加(P均<0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠逃到安全區(qū)時間、逃到安全區(qū)次數(shù)比較

2.2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目比較 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞多數(shù)外形及結(jié)構(gòu)正常，胞膜、胞核外形規(guī)整，胞核梭形固縮、深染情況很少，未發(fā)現(xiàn)核破碎情況。SAH組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞胞核梭形固縮、深染情況明顯增多，并有較多核破碎及溶解現(xiàn)象(見圖1)。納洛酮組與SAH組相比，胞核梭形固縮、深染、核破碎情況均明顯較少。納洛酮組、SAH組、假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目分別為(96.78±3.83)、(79.00±6.07)、(120.83±7.63)個/HP。與假手術(shù)組比較，SAH組正常形態(tài)及結(jié)構(gòu)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)；與 SAH 組比較，納洛酮組正常形態(tài)及結(jié)構(gòu)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多(P<0.05)。

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)及海馬組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達比較 假手術(shù)組可見少數(shù)細(xì)胞的胞質(zhì)中顯現(xiàn)出淡黃色、淺褐色或淡棕色的細(xì)沙樣顆粒狀物質(zhì)；與假手術(shù)組比較，SAH組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)目均增加(P均<0.05)；與SAH組比較，納洛酮組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)目均增加(P均<0.05)，詳見圖2、圖3及表2。

假手術(shù)組Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白量處于較低水平。與假手術(shù)組比較，SAH組海馬組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達升高(P均<0.05)；與SAH組比較，納洛酮組海馬組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達升高(P均<0.05)，詳見圖4、表2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1陽性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色,×400)

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色，×400)

圖4 各組大鼠海馬區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白電泳圖

表2 各組大鼠海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)目及蛋白表達

3 討論

各種病因引發(fā)顱內(nèi)血管破裂是導(dǎo)致SAH的主要原因，大部分患者為顱內(nèi)動脈瘤破裂所致。SAH發(fā)生后會出現(xiàn)全腦組織供血供氧的減少[5]、微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能的破壞[6]以及血細(xì)胞崩解后毒性物質(zhì)的釋放[7]，在這些因素的作用下會出現(xiàn)血腦屏障通透性增加、腦細(xì)胞能量代謝障礙、氧化應(yīng)激加劇以及炎癥反應(yīng)增強等損害性結(jié)果的發(fā)生，最終導(dǎo)致腦組織水腫、顱內(nèi)壓增高及腦血管痙攣等[8]，屬于嚴(yán)重的腦血管疾病之一，具有較高的致死率[9]。大部分存活下來的患者存在一定的神經(jīng)損傷及神經(jīng)功能障礙。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，藥物治療、手術(shù)治療等治療方法的不斷改進，SAH的病情能夠得到有效控制，但遠期神經(jīng)學(xué)結(jié)果仍未取得顯著改善[10，11]。因此，明確SAH發(fā)病后的損傷機制，減少神經(jīng)功能損害，是臨床急需解決的問題[12，13]。

納洛酮屬于羥二氫嗎啡酮衍生物，為特異性阿片受體拮抗藥物，本身不具有激動阿片受體活性[14，15]。納洛酮能夠解除類阿片藥物過量中毒和全麻術(shù)后持續(xù)的呼吸抑制[16，17]。研究[18，19]顯示，納洛酮能夠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)3種阿片受體結(jié)合形成特異性拮抗，減輕β-內(nèi)啡肽和強啡肽等對腦組織的損傷，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。研究報道顯示，納洛酮對SAH患者具有腦保護作用，但相關(guān)機制尚不明確。本實驗采取顱內(nèi)動脈穿刺法造模，同時給予納洛酮干預(yù)。穿梭箱實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAH組逃到安全區(qū)時間延長、逃到安全區(qū)次數(shù)減少；與SAH組相比，納洛酮組逃到安全區(qū)時間縮短、逃到安全區(qū)次數(shù)增多，表明納洛酮能夠有效保護SAH后大鼠的學(xué)習(xí)記憶。HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAH組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)很多出現(xiàn)異常，胞核梭形固縮、深染情況明顯增多，并有核破碎及溶解現(xiàn)象；與SAH組相比，納洛酮組異常形態(tài)和結(jié)構(gòu)的細(xì)胞明顯減少，說明納洛酮注射液能夠減輕SAH對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的損害。

目前對SAH損傷機制研究的結(jié)果顯示，自噬參與到SAH后的病理進程中。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)特有的一種自我保護機制[20]，借助自噬機體能夠及時有效地降解細(xì)胞內(nèi)功能不良或無功能的細(xì)胞器及有害物質(zhì)，并能夠為細(xì)胞供應(yīng)所需的物質(zhì)，以合成機體所需的蛋白質(zhì)或協(xié)助完成相應(yīng)細(xì)胞器的代謝，進而穩(wěn)定細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境并避免細(xì)胞發(fā)生破碎[21]。但是自噬也具有雙面性，在一定程度上發(fā)生的自噬能夠有效穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、降低死亡細(xì)胞的數(shù)量、最大程度維護機體功能[22]，但自噬反應(yīng)過于強烈或明顯不足，就會導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞，死亡細(xì)胞數(shù)量明顯上升，進而損害機體的一系列功能[23]。目前，自噬在腦缺血性疾病、心臟疾病及帕金森等多種疾病的病理過程中有著較為深入的研究[24，25]。但在SAH中，自噬的作用機制研究還仍處于開始階段[26，27]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，給予不良刺激誘導(dǎo)組織細(xì)胞發(fā)生自噬后6 h就能檢測出自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1及LC3的表達，24 h達到峰值，72 h的自噬標(biāo)志蛋白檢測結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上仍有意義。本實驗取細(xì)胞自噬后24 h為時間節(jié)點，結(jié)果顯示SAH組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)目及Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達均高于假手術(shù)組，而納洛酮組高于SAH組，表明納洛酮可以增強SAH大鼠腦細(xì)胞自噬。

綜上所述，納洛酮能夠改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增強SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬,有效穩(wěn)定SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。但本次實驗未能進一步探討納洛酮對SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的具體作用機制，有待深入研究。