小鼠腦出血后繼發性腦損傷調節因子Lpar1 mRNA和miR-200b的篩選、靶向關系預測驗證

侯小紅，周桂銀，向成明，樊銀春，姚聲濤

遵義醫科大學附屬醫院，貴州遵義563000

腦出血(ICH)是神經外科常見的腦血管疾病，是一種破壞性的腦卒中亞型，致死率、致殘率高，同時伴有不同程度的神經功能障礙[1～3]。在我國，ICH呈逐年上升的趨勢，常見于40～70歲中老年患者[4]。ICH確切病因目前尚不清楚，研究發現與原發性高血壓、動脈粥樣硬化及血管畸形等因素緊密相關，ICH后腦損傷和患者不良預后密切相關，給社會、家庭帶來極大經濟負擔。ICH后腦損傷機制復雜，其中包括最初的物理損傷和血腫的占位效應所引起的原發性腦損傷，以及氧化應激、炎癥反應及細胞毒性損傷等病理生理反應造成血腦屏障的破壞、腦水腫和神經細胞的死亡為特征的繼發性腦損傷。現已證實，多種炎癥反應都存在于ICH后的繼發性損傷中，而小膠質細胞在繼發性損傷中扮演重要的角色[5, 6]。小膠質細胞是中樞神經系統重要的免疫細胞，主要極化為M1、M2型， M1型小膠質細胞主要可以分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子而發揮促炎作用， M2型小膠質細胞可以分泌TGF-β、IL-10等抑炎因子發揮抑炎作用，恢復體內平衡[7, 8]，在ICH后繼發性腦損傷中發揮著關鍵作用。影響小膠質細胞分泌炎癥因子的因素眾多，其中非編碼RNA中的miRNA占據關鍵一環，在多種疾病的發生發展、病理、生理中扮演著重要作用，但是miRNA在ICH中的研究尚少。2019年4～5月，我們通過C57小鼠建立ICH模型，對ICH小鼠及假手術小鼠進行全轉錄組測序分析，篩選兩種小鼠中差異表達的mRNA、miRNA，并篩選出關鍵基因溶血磷脂酸受體1(Lpar1)及其上游靶基因miR-200b，進一步在ICH小鼠及LPS處理的小膠質細胞中觀察Lpar1 mRNA、miR-200b的相對表達量，以驗證篩選結果，同時觀察了miR-200b對炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物及細胞：C57無特定病原體級健康雄性小鼠18只，體質量20～25 g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供。所有小鼠分籠飼養在通風良好的恒溫環境，水和食物充足。數據庫：STRING數據庫、CTD數據庫(http://ctdbase.org/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRDB(http://mirdb.org/)。小鼠小膠質細胞系(BV-2)細胞從上海生科院細胞資源中心購買。試劑及儀器：MEM培養基購自武漢普諾賽公司，脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，丙酮酸鈉購自北京索萊寶公司，由上海生工完成相關引物的設計與合成，實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)購自日本TaKaRa公司，Ⅶ型膠原酶購自美國Sigma公司。小動物立體定向注射儀購自德國萊卡公司。

1.2 ICH模型的建立及分組 將小鼠按照簡單隨機法分為假手術組(Sham組)6只、ICH組12只，其中3只Sham組小鼠和3只ICH組小鼠用于全轉錄組測序，其余小鼠用于表達驗證。

取10～12周齡雄性C57成年小鼠，3.5%水合氯醛按10 mL/kg腹腔注射麻醉后，暴露顱骨和前囟；于前囟后約0.2 mm，中線右旁開2.5 mm，用注射器針頭鉆一直徑約0.5 mm的圓形骨窗，不損傷硬腦膜，微量注射器針頭沿骨窗垂直進針，深度約4.0 mm，緩慢均速推注膠原酶0.5 μL，整個注射過程10 min內完成，注射完畢后停針10 min，再緩慢退出微量注射器針頭，再次消毒皮膚后縫合切口。假手術組只進針，不注射膠原酶，操作步驟同ICH組。

1.3 ICH組及Sham組小鼠差異表達基因、ICH后腦損傷相關關鍵基因及miRNA的篩選 取3只Sham組小鼠和3只ICH組小鼠處理側基底節區腦組織通過二代測序方法進行全轉錄組測序分析。R軟件對測序的mRNA和miRNA進行篩選，篩選出差異表達的基因(DEGs)，并將DEGs通過相應的熱圖和火山圖可視化，篩選條件為LogFC絕對值>1，P<0.05。采用STRING數據庫對上調差異表達的mRNA進行蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)構建，物種選擇人，相互作用關系置信度大于0.4。利用“MODE”插件查找關鍵基因簇并確定感興趣的關鍵基因，得到ICH相關關鍵基因為Lpar1。同時在Comparative Toxicogenomics Database(CTD)數據庫(http://ctdbase.org/)中預測關鍵基因與神經系統疾病的相關性。

對差異表達的miRNA與Lpar1做Person相關性分析，條件為P<0.05，相關系數絕對值≥0.5。同時利用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://mirdb.org/)數據庫預測Lpar1可能的上游miRNA, 最終將與Lpar1呈負相關的miRNA取交集。選出Lpar1上游可能結合的靶向miRNA為miR-200b

1.4 ICH小鼠基底節區腦組織及LPS誘導的小膠質細胞中Lpar1 mRNA、miR-200b的檢測 分別于建模后第1、3、7天采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測Sham組、ICH組基底節區腦組織Lpar1和miR-200b，根據說明書進行加樣，每組設3～4個復孔；以U6為內參，采用miRNA相對定量，即2-ΔΔCt方法計算靶基因相對表達量。PCR引物序列見表1。分別用PBS(2 mL)、LPS(100 μg/mL)刺激BV-2細胞48 h，采用qPCR檢測Lpar1和miR-200b。

表1 受檢基因的PCR引物序列

1.5 轉染miR-200b模擬物的BV-2小膠質細胞中Lpar1 mRNA和炎癥因子的檢測 將BV-2細胞接種于完全培養基(89 mL MEM培養基+9 mL胎牛血清+1 mL雙抗+1 mL丙酮酸鈉)中，分為miR-200b對照組和miR-200b過表達組，每組3個復孔，在37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。將1～5×105個細胞接種在6孔板中，使轉染時的細胞密度能達到30%～50%；miR-200b過表達組將稀釋好的miR-200b模擬物加入板中，miR-200b對照組不加任何物質。隨后將培養板置于37 ℃ CO2培養箱中繼續培養48 h，通過qPCR檢測轉染效果，并檢測Lpar1 mRNA和炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)。PCR引物序列見表1。檢測方法同1.4。

2 結果

2.1 Lpar1、miR-200b的獲取 兩組共得到869個差異表達mRNA和106個差異表達的miRNA, 包括545個下調mRNA和424上調mRNA，55個下調miRNA和51上調miRNA。利用上調差異表達的mRNA構建的蛋白互作網絡中共153個相互作用蛋白，235個蛋白間相互作用關系，區域蛋白聚類指數為0.71，蛋白相互作用關系顯著(P<0.05)，Lpar1是關鍵基因之一見圖1，也作為本次研究感興趣的基因，與ICH密切相關，見圖2。通過兩數據庫的上游預測，分別得到693個和96個miRNA可能與Lpar1靶向結合，通過相關性分析，得到22個與Lpar1呈正/負相關關系的miRNA，見圖3，與負相關的miRNA取交集后得到miR-200b。

圖1 上調差異表達mRNA的PPI中關鍵基因簇

圖2 CTD數據庫中預測的Lpar1基因與神經系統疾病的相關性

圖3 Lpar1與差異表達miRNA相關性網絡圖

2.2 Lpar1、miR-200b在ICH 小鼠及LPS誘導的小膠質細胞中的表達 ICH組建模后第1、3、7天Lpar1 mRNA相對表達量分別為2.05±0.12、2.97±0.11、2.96±0.09，miR-200b相對表達量分別為0.52±0.07、0.38±0.06、0.40±0.04；Sham組Lpar1 mRNA、miR-200b相對表達量分別為1.01±0.05、1.03±0.09。與Sham組比較,ICH組各時間點Lpar1 mRNA相對表達量升高,miR-200b相對表達量降低(P均<0.05)。

LPS誘導的小膠質細胞中Lpar1 mRNA、miR-200b相對表達量分別為2.93±0.38、0.55±0.06，加入PBS后的小膠質細胞中Lpar1 mRNA、miR-200b相對表達量分別為1±0.19、1±0.05，兩種細胞Lpar1 mRNA、miR-200b相對表達量比較，P均<0.05。

2.3 miR-200b過表達組及miR-200b對照組 Lpar1 mRNA、炎癥因子表達比較 與miR-200b對照組比較，miR-200b過表達組Lpar1 mRNA、IL-6 mRNA、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA相對表達量降低(P均<0.05)，見表1。

表1 miR-200b過表達組及對照組 Lpar1 mRNA、炎癥因子相對表達量比較

3 討論

ICH是一種常見的破壞性腦血管疾病，ICH后繼發性腦損傷是預后不良的因素[9]，其發生涉及多種機制，研究[10, 11]發現miRNA是其中影響繼發性腦損傷重要因素。近年來，非編碼RNA的研究備受關注，在人類的所有基因中，非編碼基因約占98%，在我們對非編碼基因的研究探討中發現，非編碼基因在多種疾病的發生發展、病理、生理中起重要作用。miRNA是一種內源基因編碼的非編碼單鏈RNA，長度約22個核苷酸。

本研究我們通過高通量測序聯合生物信息學分析，最終確定本研究的基因Lpar1和miR-200b。測序數據結果顯示miR-200b在小鼠ICH組中表達下調，而Lpar1表達上調，表達呈負相關關系，這一結果在本次研究中得到了驗證。 在Lpar1與疾病的相關性分析中，發現Lpar1與免疫系統疾病、ICH、腦水腫、腦損傷都具有很大的相關性，表明Lpar1可能是神經系統疾病的關鍵基因。神經系統疾病中G蛋白偶聯受體和小膠質細胞關系密切，G蛋白家族中成員可通過影響G蛋白偶聯受體的活化狀態影響小膠質細胞的極化，從而調節神經系統的炎癥反應[12,13]，Lpar1來自EDG受體，是G蛋白偶聯受體超家族的成員，具有由六個不同的G蛋白偶聯受體(LPAR1-6)作為細胞外信號轉導分子的能力，是腦發育和神經系統功能所必需[14]。研究發現LPA相對表達量增加可促進小膠質細胞遷移反應，從而增加炎癥反應[8]。本研究中，Lpar1在小鼠腦出血和LPS誘導的小膠質細胞模型中高表達，與既往在神經系統中的研究結果一致，表明Lpar1可能是ICH繼發性炎癥反應的關鍵調節因子。

miRNA與mRNA的3′UTR區靶向結合可使靶基因表達沉默或翻譯受抑制，最終影響疾病的發展[15，16]。Wen等[17]在對腦梗死研究中，發現miR-200b的表達可影響小膠質細胞的活化，進而影響腦水腫程度及神經炎癥反應。Jadhav等[18]在對神經系統炎癥反應的研究中，發現miR-200b的過表達可通過MAPK信號通路抑制神經炎癥反應。本研究發現，miR-200b在小鼠ICH模型和LPS處理的小膠質細胞模型中都表現為低表達，這一結果與文獻報道結果相符，進一步在LPS誘導的小膠質細胞模型中過表達后發現可抑制促炎因子IL-6，IL-1β和TNF-α釋放，結合以上結果，我們推測在ICH后，miR-200b表達下降減輕對Lpar1的表達抑制，促使Lpar1表達上調，進而促進促炎因子釋放，加重ICH繼發性炎癥反應，但具體機制需進一步研究探索。

綜上所述，相比Sham組小鼠，ICH組小鼠mRNA有545個下調和424個上調，miRNA 有55個下調和51個上調。在ICH組小鼠及LPS處理的小膠質細胞中，關鍵基因Lpar1高表達、miR-200b低表達，miR-200b可抑制小膠質細胞炎癥反應。Lpar1、miR-200b可能是ICH后繼發性炎癥反應的關鍵調節因子，并可能成為將來ICH潛在的治療靶點。