急性白血病患者流式細胞術外周血細胞檢測的臨床意義

姚聲盛，劉小敏，楊曉婷

深圳市龍華區中心醫院檢驗科，廣東深圳 518110

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是臨床常見的血液系統惡性腫瘤， 主要病理特點為骨髓中異常原始細胞和幼稚細胞大量增殖，并抑制骨髓的造血功能[1]。 AL 如不能有效治療，患者的平均生存時間僅為3 個月，嚴重者甚至在確診后數日內死亡[2]。 近年來，隨著現代醫學技術的飛速發展，AL 的治療方案不斷更新， 治療效果也明顯提高，初診AL 的緩解率也較前提高。 但在實際的臨床工作中，仍有部分患者緩解后還會復發。 目前的研究認為，完成治療后， 患者體內微小殘留病 （minimal-residual disease，MRD）的存在是AL 復發的主要因素[3]。檢測AL 患者MRD對于判斷預后，指導治療具有重要意義[4]。 目前，國內多主張應用流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測骨髓樣本的MRD，但骨髓穿刺創傷性大，且取得的標本僅能反應該部分骨髓的狀況[5]。 該研究對 2016 年 1 月—2018 年 6 月期間收治的136 例AL 患者應用FCM 檢測外周血MRD，以探討AL 患者應用FCM 進行外周血細胞檢測的臨床意義。 現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇該院血液科收治的AL 患者136 例，所有患者均符合WHO 制定的AL 診斷及分型標準[6]；且初次診斷為AL，并排除急性早幼粒細胞白血病和其他血液系統疾病，均無白血病史， 無其它惡性腫瘤及心肝腎嚴重器質性疾病， 入組前未接受白血病的相關治療。 急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者 74 例，男 41 例，女 33例，年齡 24～67 歲，平均（41.8±9.2）歲；急性淋巴白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）62 例， 男 35 例， 女 27例，年齡 22～68 歲，平均（40.5±8.7）歲。 所有入選研究對象對該研究均知情同意，并簽署協議書。

1.2 方法

AML 組接受 MA 或 HA 化療方案 （米托蒽醌/高三尖杉酯堿聯合阿糖胞苷） 誘導緩解；ALL 組接受VDLP 化療方案（長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松）誘導緩解，所有受試者均化療結束后3 d 內抽取上午空腹靜脈血4 mL，EDTA-2K 抗凝，分別置入由異硫氰酸熒光素、多甲藻葉綠素蛋白、藻紅蛋白、別藻青蛋白免疫標記的試管內進行免疫分型檢測， 每個試管均加入有核細胞100萬個，根據患者的病變特點選擇合適的單克隆抗體。 收集不少于10 萬個有核細胞進行分析， 應用EPICS-ALTRA型流式細胞儀進行細胞收集，應用BECKMAN-COULTER公司提供的配套軟件分析。 依據原始細胞抗原的表達情況（表達跨系與否、同步與否、強弱情況、是否丟失）判定是否MRD，MRD 含量≥0.01%則判斷為陽性，＜0.01%判斷為陰性。 對所有受試者進行骨髓穿刺，抽取骨髓液涂片8張，吉姆薩-瑞氏染色，顯微鏡下分類200 個細胞，根據形態進行分類計數，如原始、幼稚淋巴細胞占骨髓有核細胞的百分比＞5%時則判定為復發[6]。

以骨髓細胞學形態改變（增生1 級或2 級；原始細胞數量增加≥20%）作為MRD 診斷的金標準，評價FCM 檢測對MRD 的診斷效能。

1.3 統計方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件分析統計數據，該研究主要數據為計數資料， 以百分率表示，FCM 檢測的MRD 陽性和陰性患者復發率的比較采用校正χ2檢驗， P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FCM 外周血檢測對MRD 的診斷效能

所有AL 患者中骨髓像檢測MRD 陽性92 例，其中陰性 AML 患者 49 例，ALL 患者 43 例，FCM 檢測對 AML 患者MRD 的診斷的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、 準確度分別為 98.0%、52.0%、80.0%、92.9%、82.4%；對ALL 患者MRD 的診斷的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、 準確度分別為 93.0%、63.2%、85.1%、80.0%、83.8。 見表 1、表 2。

表1 FCM 檢測AML 患者MRD 的診斷情況Table 1 MRD diagnosis of AML patients detected by FCM

表2 FCM 檢測ALL 患者MRD 的診斷情況Table 2 MRD diagnosis of ALL patients detected by FCM

2.2 AL 患者MRD 陽性與復發率的關系

對 AL 患者隨訪 1 年，AML 組、ALL 組 MRD 陽性患者復發率 （73.5%、69.8%） 均高于 MRD 陰性患者 （32.0%、26.3%），差異有統計學意義（P<0.05）。 見表 3。

表3 AL 患者復發情況（%）Table 3 Recurrence of AL patients

3 討論

AL 患者是威脅人類健康的造血系統惡性腫瘤， 近年來隨著醫療水平的飛速提高和藥物研究不斷深入， 該病首次化療緩解率明顯提高， 絕大多數白血病細胞經過誘導治療后能夠被殺死，但仍難以達到徹底清除的高度，仍有部分患者化療緩解后復發[7]。 MRD 的存在是AL 患者復發的關鍵因素， 化療后檢測MRD 水平對于評價療效、預后判斷均具有重要意義。目前，骨髓細胞形態學檢測是AL診斷的金標準，也是療效評價的常用指標，但骨髓穿刺取得的標本僅反映該區域的骨髓情況， 且當患者體內白血病細胞含量超過1%才能檢測出來[8]。 雖然骨髓穿刺液中含有較高比例的白血病細胞 ， 但骨髓穿刺過程往往會發生血液稀釋并導致MRD 測定值降低，血液科醫師可能過低估計患者的MRD 水平，并可能由此導致臨床決策的失誤。 近年來的研究發現，AML 患者化療后白血病細胞在骨骼中的分布存在一定異質性，因此，骨髓液MRD 檢測為陰性也有可能是骨髓穿刺未穿到白血病細胞駐留的部位所致[9]。

AL 患者MRD 在外周血中會有所體現， 采集外周血進行MRD 檢測可全面反映AL 患者的預后， 且外周血標本獲取方便，創傷小，患者容易接受；檢測時干擾細胞少，分析MRD 異常免疫表型會更準確。FCM 是一種綜合了電子學、細胞免疫學、細胞化學等多種學科技術的細胞檢測方法，具有檢測方便、速度快、敏感度和特異性高等優勢，可在細胞水平辨認白血病細胞的大小、顆粒和熒光特征，對AL 患者外周血中MRD 細胞進行相對和絕對計數，是檢測 AL 患者 MRD 的理想手段[10-11]。 Zeijlemaker 等[12]研究也認為應用FCM 計數進行外周血MRD 檢測可能替代骨髓液檢測，成為評價AML 患者化療后復發情況的有效方法。 有關學者[13]的研究對比分析了AL 患者外周血和骨髓液中的MRD 水平，發現不同病理類型、不同化療方案患者上述測定值可能會發生變化， 但二者會保持一定的比例關系。 另有研究[14]也認為ALL 患者外周血和骨髓MRD檢測有較好的一致性，外周血MRD 檢測可用于ALL 患者預后的評價。 盡管AL 患者（尤其AML 患者）化療后白血病細胞在全身骨骼分布中存在異質性，但只要MRD 細胞由骨髓釋放入血液，都可通過FCM 計數檢測出。

該研究結果顯示，AML 組、ALL 組 MRD 陽性患者復發率 （73.5%、69.8%） 均高于 MRD 陰性患者 （32.0%、26.3%）（P<0.05），與 Zeijlemaker 等報道相似：誘導治療 1年后的累計復發率，PB mrd 陰性患者為29%，PB mrd 陽性患者為 89% (P<0.001)。 mrd 陰性患者 3 年 OS 為 52%，mrd 陽性患者 3 年 OS 為 15% (P=0.034)。 有研究[15]檢測了115 例 AML 患者外周血 MRD 情況， 發現外周血 MRD 測定值較高的AML 患者長期預后相對較差。 該研究也發現MRD 陽性表達的AML、ALL 患者， 其復發率也顯著高于同組的MRD 陰性表達患者， 表明MRD 陽性可能與骨髓中白血病細胞的存在有密切關系， 但該研究隨訪時間較短，至隨訪結束仍有部分MRD 陽性患者骨髓細胞形態檢測未找到復發的充足依據。 到目前為止得出的實驗數據已提示MRD 陽性的AL 患者存在高復發風險，MRD 是反應AL 患者預后的重要因素。相關研究也發現MRD 水平＞0.01%的AL 患者， 其3 年復發率是＜0.01%患者的3 倍以上，并認為化療后MRD 檢測持續陰性可停止治療，如持續陽性則考慮進一步治療。

綜上所述，FCM 診斷外周血MRD 具有較高的敏感性和準確度，在AL 患者化療后復發的評價中具有較高的臨床價值。