天麻醇提取物灌胃對帕金森病大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用及其機(jī)制

郭沛鑫，雷娜，吳海妹，李江蕊，茍向薇，解宇環(huán)

云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500

帕金森病(PD)是一種常見的中老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著人口的老齡化，PD已成為威脅人類健康的主要疾病[1]。PD主要病理變化是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元缺失，多巴胺能神經(jīng)功能相對減弱、膽堿能神經(jīng)功能相對增強(qiáng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)運(yùn)動減少、僵直、震顫等臨床癥狀[2]。近年研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙、鈣超載、鐵離子的堆積、免疫炎癥等均能造成氧化性損傷，促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元凋亡。抗氧化治療為PD患者治療的新方向。中藥天麻為蘭科天麻屬植物天麻的根莖，有息風(fēng)定驚、平肝潛陽等功效。近年，關(guān)于天麻抗PD的研究報(bào)道較多[5,6]，但天麻抗PD的物質(zhì)基礎(chǔ)研究卻未見報(bào)道。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，天麻脂溶性成分有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用，提示脂溶性成分可能是天麻抗PD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。2018年4～5月，本研究通過用95%乙醇提取天麻脂溶性成分(即天麻醇提取物)，觀察天麻醇提取物對PD大鼠認(rèn)知障礙的改善作用,并探討其機(jī)制，為指導(dǎo)天麻治療PD的臨床合理用藥和開發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 120只SD雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量250～350 g，由四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-12，自由飲食、普通光照飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。美多巴購于上海羅氏制藥有限公司，批號：SH2061；6-OHDA購于Sigma公司，批號：1002007845；鹽酸去水嗎啡購于Sigma公司，批號：1001753747；脂質(zhì)過氧化物(LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。68001型腦立體定位儀購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；YP10001電子稱購于上海越平科學(xué)儀器有限公司；FA1004型分析天平購于昆明安普科技有限公司；J.J-2A/LC1017-2A雙通微量注射泵購于上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；DFY-200搖擺式中藥粉碎機(jī)購于溫齡市林大機(jī)械有限公司；ZDHW調(diào)溫電熱套購于北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵購于鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置購于上海愛明儀器有限公司；OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購于上海愛明儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋購于國華電器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于上海一恒科技有限公司；63003型Morris水迷宮購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；M200PRO酶標(biāo)儀購于北京博宇騰輝科貿(mào)有限公司。

1.2 天麻醇提取物的制備 由本實(shí)驗(yàn)室自制。制法：用搖擺式中藥粉碎機(jī)將天麻打粉至粗粉，用電子稱稱取天麻粗粉放入圓底燒瓶，加入5倍量95%乙醇回流2 h，抽濾；濾渣加5倍量95%乙醇繼續(xù)回流1 h，抽濾；隨后濾渣再加5倍量95%乙醇再回流1 h，抽濾。合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，將濃縮液轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋揮至浸膏狀，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，即得天麻醇提取物。

1.3 PD大鼠模型的制作、動物分組及天麻醇提取物的給予方法 將SD雄性大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上，門齒低于耳桿2.3 mm，根據(jù)Paxson《The Rat Brain》圖譜，用6-OHDA行腦立體定位注射，制作PD大鼠模型，方法為：將含0.2%抗壞血酸的6-OHDA溶液(濃度：5 μg/μL)分別注入右中腦腹側(cè)被蓋部(VTA，坐標(biāo)為AP=-4.8 mm, ML=-1.2 mm, DV=-8.2 mm)和黑質(zhì)致密部(SNc，坐標(biāo)為AP=-4.8 mm, ML=-2.0 mm, DV=-8.0 mm)各4 μL，留針5 min，緩慢退針。傷口處涂抹硫酸慶大霉素，縫合。2周后腹腔注射鹽酸去水嗎啡0.5 mg/kg誘導(dǎo)大鼠向健側(cè)轉(zhuǎn)圈，以平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7 r/min的大鼠為造模成功大鼠[9]。取PD模型制作成功大鼠隨機(jī)分為模型對照組(給予等體積蒸餾水)、美多巴組(7.8 mg/kg)、天麻醇提取物低劑量組(5 g生藥/kg)、天麻醇提取物中劑量組(10 g生藥/kg)及天麻醇提取物高劑量組(20 g生藥/kg)，另取正常大鼠作為空白對照組(給予等體積蒸餾水)，每組8只。各組動物按上述劑量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)21 d。

1.4 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙程度評價(jià) 在給藥期間每周進(jìn)行1次行為學(xué)檢測：腹腔注射鹽酸去水嗎啡(0.5 mg/kg)，記錄注射5 min后30 min內(nèi)各組大鼠恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)圈數(shù)，每1個(gè)360度旋轉(zhuǎn)計(jì)數(shù)1次。比較各組動物的轉(zhuǎn)圈數(shù)，以此評價(jià)大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙程度[10]。

采用水迷宮實(shí)驗(yàn)[11]評價(jià)神經(jīng)行為學(xué)改善程度。Morris水迷宮為直徑1.2 m、高0.9 m的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深0.5 m，水溫保持在(22±2)℃，房間內(nèi)光照恒定，無光線直射在水池內(nèi)。池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，在目標(biāo)象限(設(shè)為3象限)內(nèi)距離池壁35 cm處放有直徑為10 cm高23 cm的圓形黑色站臺，站臺位于水面下2 cm。池壁內(nèi)側(cè)貼有不同形狀的標(biāo)記物。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動軌跡。方法如下：①記憶訓(xùn)練期(第1、2天)：將大鼠面朝池壁放入水中游泳60 s，第1天引導(dǎo)其登上平臺，第2天若在60 s內(nèi)動物沒有登上平臺則繼續(xù)引導(dǎo)其登上平臺，停留15 s后放入溫暖干燥的籠子結(jié)束訓(xùn)練。②記憶增強(qiáng)期(第3、4、5天)：每只動物每天早晚各1次實(shí)驗(yàn)，每次分別從除平臺所在方位外的3個(gè)方位各放1次，每只動物放入水中的間隔時(shí)間為15 s。動物單次游泳時(shí)間為60 s，若大鼠在60 s內(nèi)不能上臺則引導(dǎo)其登上平臺適應(yīng)15 s后進(jìn)行下次實(shí)驗(yàn)。最后將大鼠擦干放入鼠籠。③空間探索實(shí)驗(yàn)(第6天)：撤除平臺，將大鼠從與平臺相對的方位面朝池壁放入水中，讓大鼠自由游泳60 s后將動物擦干放入鼠籠。觀察大鼠在平臺所在象限的距離百分比(PT%)和停留時(shí)間百分比(T%)，以此來評價(jià)藥物對大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響(PT%和T%值越大，表明大鼠的認(rèn)知記憶能力越強(qiáng))。采用Smart2.0 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行信息處理。

1.5 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 大鼠認(rèn)知行為學(xué)測定后，以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動脈取血，于4 000 r/min離心5 min，分離血清，分別按試劑盒的操作說明書測定大鼠血清LPO、GSH-Px、SOD、MDA。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知功能比較 與模型對照組比較，連續(xù)給藥3周(21 d)，美多巴組大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)先升高后降低;在第3周末，美多巴組、天麻醇提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組PD大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)有降低趨勢，但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果詳見表1。與模型對照組比較，美多巴組、天麻醇提取物高劑量組在水迷宮的PT%和T%明顯增加(P均<0.05),見表2。

表1 各組給藥前后大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù) (圈，

表2 各組大鼠PT%、T% 比較

2.2 各組血清LPO、GSH-Px、SOD、MDA含量比較 與空白對照組比較，模型對照組血清中LPO、MDA含量升高，血清GSH-Px、SOD含量降低(P<0.01)。與模型對照組比較，天麻醇提取物高劑量組大鼠血清中LPO含量降低(P<0.05),天麻醇提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組血清中GSH-Px、SOD含量升高、 MDA含量降低(P<0.05或<0.01)，詳見表3。

3 討論

PD患者常伴隨著認(rèn)知功能障礙和氧化應(yīng)激的發(fā)生。在評價(jià)認(rèn)知功能障礙的指標(biāo)里，我們選擇了鹽酸去水嗎啡(APO)所誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)。首先，在PD大鼠認(rèn)知功能障礙的評價(jià)上，APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)是目前最重要的評價(jià)指標(biāo)。APO是一種D2受體激動劑,而6-OHDA是一種類似于去甲腎上腺素的化學(xué)制劑，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性。本實(shí)驗(yàn)利用立體定位儀，參考大鼠的大腦立體圖譜，將6-OHDA定位注射到大鼠尾殼核CPU破壞黑質(zhì)-紋狀體多巴胺系統(tǒng)，使動物毀損側(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失、受損，導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量降低，造成多巴胺和乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)失衡，從而膽堿能神經(jīng)功能相對亢進(jìn)，表現(xiàn)為PD樣的癥狀[12,13]。此時(shí)，機(jī)體反射性地認(rèn)為受損側(cè)腦區(qū)多巴胺受體數(shù)量不足，不足以結(jié)合足夠的多巴胺，以平衡乙酰膽堿的功能。因此在受體調(diào)節(jié)機(jī)制下，同側(cè)(受損側(cè))D2受體出現(xiàn)上調(diào)，產(chǎn)生超敏感現(xiàn)象，當(dāng)給予APO激動D2受體后則產(chǎn)生比健側(cè)更強(qiáng)的多巴胺活性，因?yàn)橥瑐?cè)腦區(qū)控制對側(cè)軀體的運(yùn)動，故而表現(xiàn)為向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)。給藥后，因平衡了腦內(nèi)遞質(zhì)多巴胺和乙酰膽堿水平，受損側(cè)腦區(qū)受體逐漸下調(diào)恢復(fù)正常，但因?yàn)槭荏w下調(diào)恢復(fù)正常是一個(gè)緩慢的過程，所以在給藥21 d的過程中，我們僅在給藥第3周觀察到大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)有下降趨勢，提示天麻醇提取物能緩慢改善PD大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙(陽性藥美多巴甚至在給藥的第1周和第2周有增加大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)的現(xiàn)象出現(xiàn)，這與美多巴是D2受體激動劑，在初期能增加大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有關(guān))。其次，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，通過比較大鼠PT%和T%評估動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，二者的數(shù)值越大說明動物的空間認(rèn)知記憶越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，天麻醇提取物高劑量能明顯增加PD大鼠PT%和T%，提示天麻醇提取物能增強(qiáng)PD大鼠的認(rèn)知記憶能力，改善神經(jīng)行為學(xué)障礙。

表3 各組血清LPO、GSH-Px、SOD、MDA比較

在以往的研究中，有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激-PD-神經(jīng)保護(hù)三者密切相關(guān)。氧化應(yīng)激在促進(jìn)PD疾病發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[14]。機(jī)體內(nèi)過量的自由基對機(jī)體損傷的重要原因是產(chǎn)生LPO;SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能有效清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陽離子自由基，并有終止自由基連鎖反應(yīng)的作用；MDA為脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物之一，其含量多少能體現(xiàn)機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度，從而反映神經(jīng)元受損的程度[15]。在抗氧化應(yīng)激指標(biāo)中，谷胱甘肽(GSH)是大腦中存在的最為豐富的可溶性抗氧化分子，大量存在于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞中，發(fā)揮重要的解毒劑作用[16]。GSH在黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域的水平與PD癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)，在嚴(yán)重患者中GSH水平幾乎下降為零。GSH的損耗嚴(yán)重影響多巴胺神經(jīng)元的生存，研究顯示突觸核蛋白基因突變與PD 的發(fā)生密切相關(guān)，而α-突觸核蛋白的形成與氧化型GSH的增加呈正相關(guān)[17]。GSH-Px能特異地催化還原型GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)表明，與模型對照組比較，天麻醇提取物高劑量組大鼠血清中LPO含量降低；天麻醇提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組血清SOD、GSH-Px值均升高， MDA值降低。提示天麻醇提取物具有明顯的抗氧化作用，可通過清除腦內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，減輕神經(jīng)元細(xì)胞的氧化損傷，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用，這可能是其改善PD大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制之一。