牙齦卟啉單胞菌感染增加食管鱗狀細胞癌的化療抵抗

任 超，楊海軍，張耀文，原 翔，劉怡文，高社干，周福有

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivahs,Pg)感染與口腔癌的發生是近年來一大研究熱點[1-2]。因為口腔上皮與食管上皮均為鱗狀上皮，且口腔與食管物理距離上的鏈接以及吞咽習慣等因素均可使食管上皮成為Pg的寄居地并進而可能誘發加重食管癌的發生發展[3-4]。本研究團隊前期研究報道了Pg的感染與食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)臨床病理特征及生存預后的關系，提出Pg感染與食管鱗癌的發生發展有關[5-6]。但Pg感染是否影響ESCC的療效尚未見文獻報道，本研究圍繞Pg感染與ESCC患者臨床病理特征和化療敏感性的相關性進行，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年1月至2018年12月安陽市腫瘤醫院需行新輔助化療的ESCC患者，化療方案：紫杉醇+順鉑(紫杉醇135 mg·m-2，靜脈滴注，僅用于第一天；順鉑 75 mg·m-2，靜脈滴注，分3 d輸注，21 d為1周期)，共進行2周期。休息3～4周后行手術治療。納入標準：共100例，其中男性61例，女性39例；年齡<60歲28例，≥60歲72例；經免疫組化染色確認Pg感染與否；Pg陽性者47例為觀察組，Pg陰性者53例為對照組。排除標準：治療前行放療、生物及免疫治療，嚴重的基礎疾病，預計生存期<0.5 a。收集并統計所有患者一般臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移、臨床分期、化療后療效評價[RECIST療效評價標準(2000)；統一使用CT評效]、化療后腫瘤組織病理反應及預后。該項目經過安陽市腫瘤醫院倫理委員會審核同意。

1.2 材料免疫組化SP超敏試劑盒購于中杉金橋公司，HRP標記山羊抗兔IgG抗體購于康為公司，山羊抗兔IgG(H+L)熒光抗體購于CST公司。

1.3 方法病理標本4 μm厚連續切片，進行免疫組織化學SP法染色觀察。根據切片中細胞質及細胞核著色的陽性細胞數以及著色面積進行評分，在組織切片內隨機挑選5個高倍鏡視野(200倍或400倍)，對組織切片的染色強度和染色面積進行半定量分析。染色強度評分標準為：0分，未著色，陰性；1分，著色較弱，呈淺黃色，弱陽性；2分，中性著色，呈棕黃色，中度陽性；3分，著色較強，呈棕褐色，強陽性。染色面積評分標準為：陽性細胞占0%～5%，0分；陽性細胞占6%～25%，1分；陽性細胞占25%～75%，2分；陽性細胞>75%，3分。免疫組化評分計算方法：總得分=染色強度×染色面積。0分，-，陰性；1～3分，+，弱陽性；4～8分，++，中陽性；9～12分，+++，強陽性。實驗結果統計標準：0分為陰性，>1分為陽性。

1.4 統計學方法使用SPSS 23.0軟件進行統計學數據分析。計數資料以百分率(%)表示，兩組數據組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化SP法檢測100例ESCC組織中Pg的表達Pg陽性著色定位于ESCC癌細胞的細胞質中，呈棕黃色顆粒，見圖1。Pg陽性共47例，陽性率為47.00%。

A、B、C：Pg陽性；D：Pg陰性

2.2 Pg感染與ESCC臨床病理特征和化療療效的相關性Pg感染情況與腫瘤發病年齡、腫瘤浸潤深度、腫瘤淋巴結轉移、化療后療效評價、化療后腫瘤組織反應程度存在顯著相關性(TNM分期采用AJCC第八版的食管癌分期)。見表1。

表1 Pg感染與食管鱗癌臨床病理特征的相關性 例(%)

2.2.1 Pg感染與ESCC患者年齡相關性分析對100例ESCC患者患病年齡進行相關性分析，<60歲28例，Pg陽性20例，占71.43%；≥60歲72例，Pg陽性27例，占37.50%；Pg陰性27例，占62.50%。Pg陽性表達率在<60歲組顯著高于≥60歲組(χ2=9.316，P=0.002)。

2.2.2 Pg感染與ESCC浸潤深度相關性分析對100例ESCC腫瘤浸潤深度進行相關性分析，浸潤在纖維膜以下組(黏膜層、肌層；即T1+T2)患者共38例，Pg陽性5例，占13.16%；達到及超過纖維膜組(T3+T4)患者共62例，Pg陽性42例，占67.74%。Pg陽性表達率在T3+T4組顯著高于T1+T2組(χ2=28.179，P=0.001)。

2.2.3 Pg感染與ESCC淋巴結轉移相關性分析對100例ESCC局部淋巴結轉移情況進行相關性分析，有淋巴結轉移組(N+)患者共59例，Pg陽性38例，占64.41%；無淋巴結轉移組(N0)患者共41例，Pg陽性9例，占21.95%。Pg陽性表達率在N+分期中組顯著高于N0組(χ2=17.504，P=0.001)。

2.2.4 Pg感染與ESCC化療后療效評價相關性分析參照RECIST療效評價標準(2000)，統一使用CT評估，對100例ESCC患者化療后療效評價情況進行相關性分析，療效評價達PR/CR組患者共45例，Pg陽性14例，占31.11%；療效評價達SD/PD組患者共55例，Pg陽性33例，占60.00%。Pg陽性表達率在PD/SD組中顯著高于CR/PR組(χ2=8.292，P=0.004)。

2.2.5 Pg感染與ESCC化療后腫瘤組織病理反應相關性分析對100例ESCC化療后腫瘤組織病理反應情況進行相關性分析，病理反應輕度患者共65例，Pg陽性43例，占66.15%；病理反應中/重度患者共35例，Pg感染陽性4例，占11.43%。Pg陽性表達率在化療后腫瘤組織病理反應輕度組中顯著高于病理反應中/重度組(χ2=27.352，P=0.004)。

3 討論

腫瘤是機體在多種致癌因素相互作用下，原癌基因被激活，凋亡調節基因和修復基因被改變，致使細胞凋亡受到抑制，使其克隆性異常增生而形成的。目前關于感染與腫瘤的相關研究是腫瘤學的一大熱點，而其中關于Pg促進惡性腫瘤發生發展的研究也越來越多。Pg能夠抑制宿主細胞凋亡，并且能夠改變局部炎癥環境的致病作用[2,7]；Pg對黏膜具有黏附和侵入性，進入上皮細胞后可逃避宿主免疫系統的打擊，在細胞內進行繁殖，進而可在細胞之間進行傳播[8]；Pg可通過分泌毒素和激活細胞內特定的信號傳導通路對細胞的程序性死亡進行抑制；Pg可誘使環氧化酶2和血管內皮生長因子的表達增加，增加腫瘤新生血管形成，有利于腫瘤的局部浸潤和轉移[7]；Pg還可以通過間接作用，抑制自然殺傷T細胞的功能，有利于腫瘤細胞逃脫自身免疫系統的攻擊，有利于腫瘤細胞的增殖與淋巴結轉移[8-9]。2016年高社干等[5,10]率先檢測出ESCC中Pg感染顯著高于癌旁組織，并采用高通量測序法(next-generation sequencing technology,NGS)證實了ESCC癌組織中Pg豐度顯著高于正常黏膜組和健康組，還證實了Pg感染可影響化療藥物對食管癌細胞的殺滅效果，但Pg在臨床上是否確實影響ESCC的化療療效，尚未得到研究證實。

本實驗結果顯示：Pg感染情況與腫瘤發病年齡、腫瘤浸潤深度、腫瘤淋巴結轉移、化療后療效評價、化療后腫瘤組織反應程度存在顯著相關性。化療后療效評價PD/SD組中Pg陽性表達率60.00%，顯著高于療效評價CR/PR組的31.11%，化療后腫瘤組織病理反應輕度組中Pg陽性表達率66.15%，顯著高于病理反應中/重度組的11.43%，差異具有統計學意義(P<0.05)。本研究結果表明：Pg感染可能促進了ESCC的發展；Pg感染陽性者，化療敏感性較差，即Pg感染增加了ESCC的化療抵抗。在倡導惡性腫瘤精準治療的大環境之下，檢測Pg感染將可能為ESCC化療選擇提供一種生物學指標，是否可采取對Pg感染陰性的ESCC患者行化療，而對Pg感染陽性的ESCC患者先行抗Pg治療后再行化療，或聯合抗Pg治療和化療,值得進一步深入研究。