牙齦卟啉單胞菌促進模型鼠口腔鱗癌發展

劉其偉，焦葉林，陳 攀，阮豪杰，許海軍，谷變利，劉 軻，齊義軍，張旭明，高社干

90%以上口腔惡性腫瘤起源于鱗狀上皮細胞，因此，口腔癌主要指口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)。OSCC在最常見惡性腫瘤中排名第六，至少50%的OSCC起源于舌[1]。流行病學研究已鑒定了多個與OSCC相關的危險因素，包括年齡、遺傳、飲食、抽煙、飲酒等，但確切的發病因素仍不清楚[2]。近年來，許多研究已證實細菌感染能夠增加某些腫瘤的罹患風險，如幽門螺桿菌和胃癌[3]，感染可使罹患胃癌風險增加2.7～12倍。人類口腔微生物組包括至少700種不同種類細菌，其中44%在體外分離培養并已命名，這些微生物構成了復雜的口腔微生態[4]。正常生理狀態下，口腔微生態保持動態平衡，平衡紊亂可直接損傷鄰近組織或通過異常免疫反應間接損傷遠處組織，導致人體多種疾病發生發展。口腔微生態平衡紊亂與多種疾病的發生發展關系密切。目前研究認為口腔關鍵致病菌卟啉單胞菌屬和梭狀桿菌屬的數量異常增加是造成口腔局部微生態失衡的重要原因之一[5]。與相鄰非癌組織相比，OSCC組織中發現了大量卟啉單胞菌和梭狀桿菌屬的細菌。本研究鼠上頜磨牙進行絲線結扎制備牙周炎，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide，4-NQO)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)共同作用誘導C56BL/6鼠OSCC發生發展[6]，探討P.gingivalis在鼠OSCC形成及進展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組24只6周齡、體質量(19±0.5) g的C57BL/6雄鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司。動物房溫度26 ℃，所有鼠適應1周、4種抗生素聯合處理2周后，分為4組每組6只，分別為對照組、P.gingivalis誘導牙周炎組、4-NQO組、P.gingivalis誘導牙周炎和4-NQO聯合處理組。對照組鼠常規喂飼，第8至10周牙周炎組鼠上頜第二磨牙絲線結扎，每周2次P.gingivalis口腔涂抹感染誘導牙周炎；4-NQO組、4-NQO和P.gingivalis聯合組給予8周4-NQO處理(50 μg·mL-1)。所有鼠喂飼或處理至30周時，頸椎脫臼處死。

1.2 主要試劑配制4種抗生素聯合喂飼濃度：0.1 g·L-1萬古霉素，0.2 g·L-1甲硝唑、新霉素和氨芐青霉素；丙二醇配制4-NQO儲存液的濃度為5 mg·mL-1(4 ℃避光保存)。

1.3 制備C57BL/6鼠牙周炎6 μL·g-120%烏拉坦溶液(Sigma，貨號U2500-100G)通過鼠腹腔給藥，濃度為6 μL·g-1。鼠麻醉成功后，顯微鏡下絲線結扎鼠左右上頜第二磨牙，實驗過程中如有絲線脫落，及時補扎。將對數生長期P.gingivalis細菌用2%羧甲基纖維素配制為2×1010·mL-1，每只鼠給予50 μL口腔涂抹，尤其是上頜磨牙區，每周2次，處理18周。

1.4 小鼠飼養及樣本采集整個實驗過程中觀察記錄小鼠飲水進食、體質量、活動行為等變化，30周頸椎脫臼處死所有鼠，解剖分離舌組織，肉眼檢查記錄舌黏膜表面增生、感染、出血等病變后，福爾馬林溶液固定、常規脫水、包埋、切片，HE染色。

1.5 數據處理采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理分析，小鼠體質量變化比較采用方差分析，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 建模及實驗方案為了闡明慢性感染在口腔鱗癌的發病機制，本研究結合小鼠牙周炎模型及4-NQO誘導口腔癌模型，設計了一個新方案(圖1-2)。小鼠按照以下方案進行抗生素統一處理，8周4-NQO誘導，2周絲線結扎鼠上頜第二磨牙，隨后每周2次P.gingivalis感染，30周時統一處死小鼠進行組織收集和數據分析。

圖1 口腔腫瘤誘導發生示意圖

圖2 鼠磨牙結扎制備牙周炎模型示意圖

2.2 實驗過程中小鼠體質量變化圖3顯示18、22、26、30周時各組小鼠的體質量，其中對照組和P.gingivalis組在各時間點上平均體質量變化不明顯，平均體質量約為30 g。18周時4-NQO組和4-NQO聯合P.gingivalis組體質量開始下降，隨著實驗進展，這兩組鼠體質量逐漸降低。30周時鼠舌腫瘤明顯增大、影響進食，處死各組小鼠。實驗結束時4-NQO組平均體質量為23.67 g，4-NQO聯合P.gingivalis組降低顯著、體質量最輕，平均體質量為22.55 g，與對照組和P.gingivalis組相比有統計學差異(P<0.05)。

圖3 18、22、26周和30周時各組實驗鼠體質量

2.3 舌表面變化隨著實驗進展、4-NQO作用和P.gingivalis感染時間的延長，小鼠舌黏膜相繼出現白色斑塊、乳頭狀增生及菜花樣改變并逐漸增大，但4-NQO聯合P.gingivalis組鼠的病變較4-NQO單純處理組嚴重，實驗結束時，4-NQO聯合P.gingivalis組鼠舌黏膜全部可見不規則乳頭狀增生或菜花樣改變，4-NQO單純處理組僅有2只出現上述改變。對照組和P.gingivalis組鼠在整個實驗過程中，舌黏膜呈粉紅色、舌乳頭分布均勻，舌體柔軟，無白色斑塊及菜花樣改變。見圖4。

圖4 30周時小鼠舌體大體觀

2.4 舌組織學變化舌組織HE染色可見，30周時對照組和P.gingivalis組上皮完整，基底細胞大小均一、排列整齊，未見明顯細胞增生。4-NQO聯合P.gingivalis組鼠可見體積增大的癌細胞、排列不規則、異型性明顯，癌變細胞浸潤至舌肌全層。4-NQO聯合P.gingivalis組鼠的上述各種病變均較4-NQO單純處理組嚴重。見圖5。

圖5 30周時各組實驗鼠舌組織學改變

3 討論

腫瘤的發生發展與炎癥密切相關，尤其是慢性炎癥，如慢性萎縮性胃炎、乙型或丙型肝炎[7-8]。在慢性炎癥病灶內，存在大量的浸潤炎癥細胞和炎癥介質，如細胞因子和趨化因子等。這些炎性介質不僅介導炎癥的發生發展過程，更重要的是，它們還能夠促進腫瘤細胞存活和增殖[9]。眾所周知，P.gingivalis是口腔慢性牙周炎的關鍵致病菌，并與多種疾病發生發展相關。正常生理條件下與宿主和諧共生的微生態，在P.gingivalis存在的情況下，能夠轉化為具有致病性、紊亂的微生態[10]。P.gingivalis是革蘭氏陰性厭氧菌，主要寄生于牙周炎患者的齦下菌斑中，是牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis感染引發局部炎癥反應，通過炎癥細胞和炎癥因子的作用，損傷破壞牙周組織，慢性感染還導致牙槽骨吸收，最終使牙齒脫落[11]。雖然口腔是P.gingivalis常見的定植部位，其他多種組織中也能夠檢測到P.gingivalis，如咽喉、食管、肺、動脈粥樣硬化斑塊、阿爾茨海默病腦組織等[12]。這些結果表明，P.gingivalis能夠適應多種組織微環境，通過多種機制逃逸炎癥反應及免疫系統的殺傷作用。近年來多項流行病學研究發現，P.gingivalis與OSCC之間具有密切聯系[13]，提示P.gingivalis具有致癌潛能。

本課題組前期應用qPCR和免疫組化分析了食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和癌旁組織中P.gingivalis的豐度，發現癌組織中P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織，并且癌組織中P.gingivalis富集程度與ESCC低分化、淋巴結轉移和預后不良具有明顯相關性[14]，提示P.gingivalis感染能夠促進ESCC進展。由于口腔和食管解剖位置毗鄰，組織結構相同，于是設計本研究。本研究應用4-NQO誘導的鼠口腔鱗癌模型進一步證實了P.gingivalis能夠顯著縮短4-NQO誘導的鼠OSCC發生歷程，這些富集的P.gingivalis來源于鼠牙周炎中P.gingivalis感染。OSCC發生過程中，舌黏膜經歷上皮異常增生、原位癌、浸潤性鱗癌等一系列連續的細胞表型和組織結構的異常變化。隨著癌細胞惡性程度增加，原位癌繼續發展為浸潤癌，最終形成遠處器官轉移。本研究發現，P.gingivalis能夠顯著促進OSCC早期階段癌前病變的發生和進展。通過飲水給予實驗組鼠中等劑量的4-NQO(50 μg·mL-1)8周，其后20周正常喂飼[15]，30周時部分鼠舌黏膜發生病變(發病率33%)。然而，濃度為50 μg·mL-1的4-NQO預處理8周，再通過口腔牙周炎感染P.gingivalis，30周時P.gingivalis聯合4-NQO處理組鼠舌黏膜全部可見乳頭狀或菜花狀增生病灶(發病率100%)。由此可見，P.gingivalis明顯增加了鼠OSCC發病率，而4-NQO單獨處理組的鼠舌各種病變顯著低于聯合處理組。

本研究表明P.gingivalis引發的牙周炎促進了4-NQO誘導的C57BL/6鼠舌鱗狀細胞癌的發生發展，提示P.gingivalis是口腔癌發生發展的危險因素之一，深入探討P.gingivalis參與口腔癌變過程的分子機制，可為口腔癌的預防和靶向治療提供新途徑。