丹酚酸A對高脂飲食引起的NAFLD小鼠腸道菌群異常的研究

賴尚磊 馮璐燕 丁秦超 陳歡 李松濤 竇曉兵*

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，近年來，NAFLD的發病率逐年升高，據估計全球一般人群的患病率約為20%～30%，在肥胖或糖尿病人群中高達70%～90%［1-2］。腸道微生物目前被公認為NAFLD發病的關鍵因素，肝臟和腸道有密切的解剖和功能關系，腸道菌群的相關代謝產物可以通過肝門靜脈進入肝臟，從而影響肝臟代謝，并且目前已發現在NAFLD老鼠模型和患者中，其腸道菌群的結構發生了顯著的變化［3-4］，因此腸道菌群已成為治療NAFLD疾病的新靶點。近年研究表明，中藥在治療疾病的同時調整了腸道菌群的結構［5］，這可能是中藥發揮治療作用的機制之一。中藥丹參作為“活血化瘀”藥一直被中醫作為治療NAFLD的首選，丹酚酸A（Salvianolicacid A，SAA）是丹參主要成分之一，已有研究發現SAA可減輕高脂飲食（High fat diet，HFD）誘導的NAFLD［6］，而其改善NAFLD的機制尚未完全明確。本研究旨在探討SAA對HFD誘導的小鼠肝臟脂質沉積及損傷的作用機制及其對腸道菌群的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 18只清潔級C57BL/6 雄性小鼠，8周齡，體重（25.0±0.5）g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（浙）2008-0037。

1.2 試劑和儀器 （1）試劑：SAA 購于成都曼思特生物科技有限公司（批號：MUST-17022805），高脂飼料購于美國New Brunswick 公司（批號：D12492），果糖購于美國Acros Organics 公司（批號：C16135），蔗糖購于美國 Sigma-Aldrich 公司（批號：S7903），生理鹽水購于上海振譽生物科技有限公司（批號：CZ0036），谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、游離脂肪酸（Free fatty acids FFA）、組織樣本甘油三酯（Triglycerides，TG）測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所（批號 ：C009-2，A042-2，F005-2）。（2）儀器：MR-4100酶標儀購于美國Dynatech公司，全自動樣品快速研磨儀購于上海凈信上海凈信實業發展有限公司，-80℃立式超低溫冰箱購于美國Thermo公司，Allegra? 64R低溫高速離心機購于美國Beckman公司，手掌式離心機，型號LX-100，購自海門其林貝爾儀器制造有限公司，移液槍購于德國Eppendorf公司。

1.3 NAFLD小鼠模型構建 18只C57BL/6 雄性小鼠飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心SPF環境中，動物喂養在標準飼養籠里，飼養溫度為（22±2）℃，濕度為60%，光照12h/12h晝夜循環。所有小鼠適應1周后隨機分為3組：正常對照（Ctrl）組（n=6）、高脂模型（HF）組（n=6）、高脂+丹酚酸A腹腔注射（HF+SAA）組（n=6）。Ctrl組采用普通飼料喂養，HF組及HF+SAA組采用HFD喂養：采用含60%脂肪的高脂飼料和含高果糖和高蔗糖的飲用水喂養，其中果糖含量為55%，蔗糖含量為45%，混合飲用水中共含有42g/L的碳水化合物，所有動物自由飲食及取水。Ctrl組和HF組注射生理鹽水，HF+SAA組注射丹酚酸A 40mg/（kg·d），共喂養10周。造模結束后，小鼠禁食6h后，用10%水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血，并收集小鼠組織樣本及糞便樣本，存放于-80℃立式超低溫冰箱。

1.4 檢測指標 （1）血清生化指標檢測：造模結束后，用10%的水合氯醛將小鼠麻醉，采用下腔靜脈取血，將血漿放在冰塊上靜置30min后，用4℃離心機（3000 r/min）離心15min，取上清液。用ALT和TG試劑盒測得血清的ALT和TG含量。（2）肝臟生化指標檢測：從-80℃冰箱取出肝臟組織后，置于全自動樣品快速研磨儀研磨，研磨完全后用4℃離心機（12000 r/min）離心15min，取上清液。用組織樣本甘油酶法測定試劑盒測得三組肝臟TG含量。

1.5 腸道微生物菌群的測定 采集小鼠糞便樣本，裝入1.5ml無菌離心管，采用低溫運輸（0℃）送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用Illumina Miseq?高通量測序技術獲得小鼠糞便中16s rDNA V4區序列，并基于RDP數據庫對比分析Ctrl、HF和HF+SAA三組中每只小鼠糞便中細菌的種類和豐度。

1.6 統計學方法 采用 SPSS 22.0統計軟件。對于各項連續型資料，先進行正態性檢驗，如果每組均滿足正態分布且兩組間方差齊，采用t檢驗進行組間比較；所有檢驗均為雙側檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 丹酚酸A對高脂喂養小鼠的體重及能量攝入的影響 HF+SAA組采用40mg/（kg·d）劑量的丹酚酸A對HF組的小鼠進行注射，結果顯示，丹酚酸A的注射不會影響小鼠日常食物的攝入量；與Ctrl組比較，HF組小鼠的體重明顯上升（P＜0.05），而HF+SAA組小鼠的體重相較于HF組明顯有下降（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠體重變化趨勢（±s）

表1 各組小鼠體重變化趨勢（±s）

注：與Ctrl組比較，*P＜0.05；與HF組比較，#P＜0.05

Ctrl組 HF組 HF+SAA組初始體重（g） 24.5±1.0 23.9±1.6 25.0±2.3最終體重（g） 31.6±2.2 44.1±3.5* 39.8±3.3#體重增加量（g） 7.0±1.5 20.2±2.4* 14.0±1.7#食物攝入量（g/d） 3.03±0.26 2.49±0.21 2.5±0.2

圖1 各組小鼠每周體重變化趨勢

2.2 丹酚酸A改善高脂飼料喂養的小鼠肝損傷 Ctrl組小鼠肝臟顏色鮮紅，邊緣銳利，而HF組的肝臟體積略增大，包膜緊張光滑，邊緣變鈍，顏色發黃，HF+SAA組小鼠的肝臟相較于HF組，顏色更鮮紅，邊緣較銳利（見圖2A）。Ctrl組小鼠肝臟組織細胞排列緊密，細胞核大而圓，且居中。HF組小鼠肝臟細胞排列疏松，且細胞間出現脂滴。HF+SAA組小鼠與HF組比較肝臟細胞排列較緊密，脂滴明顯減少，細胞狀態接近于對照組（見圖2B）。

圖2 小鼠肝臟及肝臟HE染色圖

2.3 血清和肝臟中的生化指標 HF組小鼠肝臟中的TG含量明顯高于Ctrl組，而HF+SAA組小鼠肝臟中TG含量明顯低于HF組。HF組小鼠血清中的ALT、FFA和TG含量明顯高于Ctrl組（P＜0.05），HF+SAA組小鼠血清中的ALT、FFA和TG含量明顯低于HF組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 血清和肝臟中的生化指標

2.4 丹酚酸A對HFD小鼠腸道菌群的影響 根據16s rDNA測序結果顯示，在HFD喂養引起的NAFLD患者中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）仍是優勢菌，但不同的研究中，其親和豐度和屬檢測有差異。而在本研究中，與Ctrl組比較，HF組Firmicutes明顯上調，Proteobacteria和Bacteroidetes顯著下調。HF+SAA組與HF組比較，Firmicutes有下降趨勢，Proteobacteria和Bacteroidetes顯著上調（見圖4）。

圖4 每組小鼠中各個菌群的分布情況

3 討論

本研究發現，SAA能有效減輕由HFD引起的小鼠體重增加，并顯著改善HFD喂養小鼠肝臟的損傷及脂質沉積，此外，SAA能顯著調控腸道菌群的結構失衡，提示腸道菌群可能參與SAA保護HFD誘導的NAFLD。

NAFLD已成為全球最常見的肝臟疾病，其通常與肥胖、胰島素抵抗和代謝綜合征的發生密切相關。HFD誘導的肝脂肪變性模型被廣泛用于NAFLD的預防和治療的研究中，本資料結果顯示，HFD喂養10周后小鼠出現了嚴重的脂肪變性和肥胖，證明了NAFLD小鼠模型的成功建立，SAA是丹參主要成分之一，具有許多潛在的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗纖維化和抗炎［7-11］，Ding等［12］研究結果首次證明SAA通過TXNIP/NLRP 3和TXNIP/ChREBP通路改善HFD誘導的肝臟脂質積累和炎癥；王潤平等［13］發現，SAA能減緩HFD誘導的LDH、SOD的升高從而減輕NAFLD。在本研究同樣證實了SAA對HFD誘導的NAFLD的保護作用，SAA能夠降低HFD誘導的血漿中ALT、FFA和TG的增加，同時減輕了肝臟的脂質沉積。這些結果均顯示SAA能有效阻止肝臟的脂肪變性。

人類腸道微生物群包含10～100萬億微生物，且腸道中的細菌數量顯著超過人體細胞總數［14］。已有研究表明，腸道和肝臟有多種相關的相互依賴性，腸-肝軸與NAFLD的進展密切相關［15］。且有證據表明與無疾病的患者比較，NAFLD患者的腸道通透性顯著增加，NAFLD疾病與腸道菌群的變化顯著相關［16］。長期HFD改變了腸道菌群及腸道屏障功能，其將會引起肥胖及肥胖相關性脂肪肝疾病［17-18］。腸道菌群在NAFLD發病機制中的參與是復雜和多因素的［19-20］，目前為止，大多數研究均集中在微生物群的菌群結構組成上，菌群中最常見的是Bacteroidetes和Firmicutes，而在NAFLD患者中，Bacteroidetes 和 Firmicutes仍然占主導地位，Mouzaki等［21］研究發現，HFD喂養后，在無菌小鼠體中接種Firmicutes組比接種Bacteroidetes組的體重、肝臟重量和肝臟脂肪顯著增加，Chen等［22］研究發現，NAFLD患者腸道菌群中Proteobacteria更豐富，其可能促進腸道對脂質的攝取。在本研究結果中同樣證實這個現象，HFD組中Firmicutes和 Bacteroidetes比例顯著高于對照組，而Proteobacteria表達豐度高于對照組。SAA干預組能顯著逆轉這類菌群結構，降低了Firmicutes和 Bacteroidetes的菌群比例，并降低了Proteobacteria的豐度，預示SAA可能通過調控菌群的結構從而影響NAFLD的進展。

綜上所述，本研究發現SAA可能通過改善HFD誘導的NAFLD小鼠腸道菌群的結構紊亂，進而減輕NAFLD的病理現象，表明SAA對NAFLD的發生發展具有顯著的抑制作用，結果提示SAA可作為防治NALFD的潛在藥物，為臨床采用SAA治療 NAFLD 提供理論參考。