小柴胡顆粒基于網絡藥理學的組方配伍規律解析

畢聰，鄭如文，黃海濤，江志強，黃偉，何逸禧，張俊華，吳灝，王永剛，劉宏*，馬蓉*

(1.廣州白云山光華制藥股份有限公司，廣東 廣州 510285；2.中山大學生命科學學院，廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心，廣東 廣州 510275)

小柴胡顆粒由柴胡、黃芩、甘草、黨參、半夏、生姜、大棗7味藥材組成，系廣州白云山光華制藥股份有限公司采用現代工藝制成的名優中藥品種[1]，具有解表散熱，疏肝和胃之功效。現代藥理學和臨床試驗已證明，小柴胡顆粒可發揮抑制炎癥、調控免疫、保肝護胃的作用。作為經典抗疫名方，小柴胡制劑被用于治療非典型性肺炎[2-3]、甲型流感[4]、登革熱等傳染性疾病，2020年被列入《廣東省新型冠狀病毒肺炎中醫藥治療方案(試行第二版)》[5]。

復方中藥具有多靶點、多途徑協同作用的特點，講究組方的辨證及藥材的配伍，其作用的本質與組方的內涵密切相關。網絡藥理學技術將系統生物學和生物信息學有機結合，通過構建藥物生物靶標網絡，能夠整體性、多層次探尋藥物復雜體系與生物復雜系統的相互作用[6]，已成功應用于中藥的靶點預測、活性成分篩選、組方科學內涵解析[7-9]等。當前，小柴胡顆粒的組方配伍僅局限于傳統方解，仍缺乏基于現代科學理論的解析。有鑒于此，本研究基于網絡藥理學技術，通過單成分濃度疊加、單靶點作用疊加、多靶點協同作用等方面，闡明小柴胡顆粒的組方的科學內涵，為其現代化、國際化發展提供依據。

1 實驗方法

1.1 活性成分篩選及交互分析 利用中藥系統藥理數據庫(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分析平臺檢索北柴胡、黃芩、甘草、黨參、半夏、生姜、大棗化學成分，保留“口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且化合物類藥性(drug-like，DL)≥0.18[10]”的成分；同時結合文獻補充各味藥材的藥效成分；構建小柴胡顆粒活性成分數據庫。進一步利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、Bioinformatics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析藥材間成分交互關系。

1.2 靶點篩選及交互分析 檢索TCMSP數據庫及參考文獻，獲取小柴胡顆粒各活性成分作用靶點。利用Venny 2.1、Bioinformatics分析藥材間靶點交互關系。

1.3 小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網絡構建 采用Perl腳本和UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)[11]將小柴胡顆粒潛在作用靶點蛋白轉化為Gene Symbol，將藥材、活性成分及作用靶點相應基因導入Cytoscape 3.7.0(https://cytoscape.org//)，構建小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網絡。將作用靶點相應基因導入插件，更新數據庫，種類設置為“Homo sapiens(人類)”，閾值設置P<0.05，其他參數保持默認，分別對潛在靶點進行GO(Gene Ontology)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析，并采用GraphPad可視化。

1.4 KEGG通路富集分析 利用Cytoscape 3.7.0“ClueGO”、“CluePedia”功能，對小柴胡顆粒及各味藥材潛在靶點進行KEGG分析，并采用GraphPad繪制各藥材富集通路熱圖。

1.5 小柴胡顆粒退熱機制分析 基于TNF信號通路，采用KEGG網站(https://www.kegg.jp/)Search & Color Pathway功能對小柴胡顆粒及各味藥材在通路中的相應靶點進行標注。

2 結果與討論

2.1 小柴胡顆粒活性成分篩選 結合TCMSP數據庫和文獻，篩選得到小柴胡顆粒167個活性成分(見表1)；至少為兩種及以上藥材共有的成分有9個(見表2)，其中槲皮素、β-谷甾醇為三味藥材共有成分(見圖1)。結果表明，不同藥材在單個成分上可能會發生濃度的疊加，從而增強該成分作用；同時不同成分可相互補充，發揮多成分協同作用。

表1 小柴胡顆粒活性成分篩選

表1(續)

表1(續)

表1(續)

表1(續)

表2 小柴胡顆粒各藥材成分交集個數

圖1 藥材間成分交互韋恩圖

2.2 小柴胡顆粒作用靶點篩選 檢索TCMSP數據庫和參考文獻，篩選得到小柴胡顆粒268個潛在作用靶點。其中柴胡成分關聯靶點174個、黃芩77個、甘草193個、黨參83個、半夏73個、生姜45個、大棗174個，各藥材關聯靶點交集見表3。柴胡、黃芩關聯靶點韋恩圖以及黨參、半夏、生姜、大棗靶點交互韋恩圖見圖2。結果表明，小柴胡顆粒可能通過單靶點疊加作用和多靶點協同作用發揮療效[12]。在單靶點疊加作用方面，小柴胡顆粒各味藥材靶點間存在著明顯的交集，不同藥材的成分可作用于同一靶點，發揮“集團軍”作用。這些活性成分可能通過相繼與靶點結合，發生濃度、時間上的疊加，從而增強藥效和時效性。在多靶點協同作用方面，小柴胡顆粒各味藥材可通過多個靶點、通路，在不同的功能模塊中產生協同性、整合性作用[13]。

圖2 君臣藥間、佐藥間靶點交互韋恩圖

表3 小柴胡顆粒各藥材靶點交集個數

2.3 小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網絡構建 將小柴胡顆粒7味藥材、167個活性成分、268個潛在作用靶點導入Cytoscape，構建小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網絡圖(見圖3)。其中綠色為藥材，粉紅色為活性成分，藍色為作用靶點。

圖3 小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網絡圖

2.4 KEGG通路分析 268個潛在作用靶點共富集得到275條作用通路，其中靶點數大于10的作用通路121條。富集靶點數排名前二十條作用通路包括pathways in cancer、metabolic pathways、human cytomegalovirus infection、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等(見圖4)，與抗病毒、炎癥、免疫、代謝等方面相關。將各味藥材的作用靶點富集到通路繪制熱圖(見圖5)，顏色越深表明該藥材在該通路富集的靶點個數越多。

圖4 小柴胡顆粒KEGG通路圖(前20條)

小柴胡顆粒中，柴胡為君藥，是常用解表藥，透泄少陽之邪、疏泄氣機之瘀滯，具有和解表里，疏肝升陽之功效，在方中起主要的治療作用。柴胡與小柴胡顆粒整體富集的通路相近，主要包括抗病毒-卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、甲型流感(influenza A)等；肝炎-乙型肝炎(hepatitis B)、丙型肝炎(hepatitis C)等；心血管-血液流變及動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)等；免疫炎癥絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)、白介素-17(IL-17)等信號通路。

黃芩為臣藥，苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，可用于治療溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽等，在方中可輔助柴胡治療主證及兼證。黃芩富集的通路主要包括人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、人類免疫缺陷病毒1感染(human immunodeficiency virus 1 infection)等自身免疫、病毒感染相關通路；麻疹(Measles)等呼吸道傳染病相關通路；絲裂原活化蛋白激酶(PI3K-AKT、MAPK)等炎癥相關通路；沙門氏菌感染(Salmonella infection)、致病性大腸桿菌感染(PathogenicEscherichiacoliinfection)等細菌感染相關通路。表明黃芩在加強君藥柴胡對免疫、抗炎、抗病毒作用的同時，還增加了處方的抗菌作用。已有報道證實，黃芩能夠抑制大腸埃希菌[14]、葡萄球菌[15-16]、沙門氏菌[17]等細菌，以及念珠菌[18]等真菌。

黨參、半夏、生姜、大棗為佐藥，除作用于抗病毒、抗腫瘤等“主證”相關通路外，還可分別作用于不同“兼證”相關通路。黨參補中益氣、健脾益肺、養血生津，作用于內分泌抵抗(endocrine resistance)、松弛素(relaxin signaling pathway)等通路，其中松弛素可通過舒張血管保護心臟免于缺血引起的損傷[19]，也可通過一氧化氮調控消化道平滑肌，影響胃腸道運動[20]，還可保護肺免受缺血-再灌注損的保護[21]。研究表明，黨參對消化系統、內分泌系統、心血管系統均有顯著調節作用[22]。大棗補中益氣、養血安神，主要作用通路為fluid shear stress and atherosclerosis等心血管相關通路。在本方中，黨參與大棗合用可發揮益氣健脾、養血生津的功效。脾主要功能包括胃腸道消化吸收和肝臟內物質轉化及能量生成[23]，“養血生津”與血管內皮功能、血液流變、造血因子增殖、唾液分泌等有關，上述通路富集結果與傳統中醫理論相契合。半夏主要作用于神經活性、激素分泌、代謝相關通路，包括神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、代謝通路(metabolic pathways)、環磷酸腺苷信號通路(cAMP signaling pathway)等，可能與半夏治療咳嗽、嘔吐、暈眩、抑郁癥功能相關。研究表明，大鼠嘔吐時迷走神經胃支傳出活動減弱，半夏可激活該活動起到止嘔作用[24]。生姜除作用于神經活性、內分泌通路外，還包括膽堿能突觸(cholinergic synapse)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)等神經傳導通路及甲狀腺激素信號途徑(thyroid hormone signaling pathway)等激素相關通路。膽堿能突觸是以乙酰膽堿為傳遞介質的突觸，而乙酰膽堿可影響胃腸道平滑肌興奮、支氣管收縮、心臟節律等生理功能。5-羥色胺則可調節肺血管平滑肌及肺循環[25]、參與腸道運動、肝生成[26]等，與止嘔功效密切相關[27]。中醫理論認為，半夏、生姜合用可和胃降逆止嘔，其機制可能與調控神經活性、神經傳導、激素分泌相關。

甘草為使藥，《本草綱目》稱之為“國老”，可調和諸藥，緩解藥物毒性、烈性，常見于抗疫和治療咳嗽方劑。研究發現，甘草可調節P-gp轉運蛋白[28]、P450代謝酶[29]等，影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄，實現調和諸藥之功效。本研究中，甘草198個靶點共富集于266條通路，涉及代謝、抗病毒、抗腫瘤、免疫炎癥等多個方面，一方面可加強君、臣藥作用，另一方面可調節藥物配伍的代謝和分布，引諸藥直達病所。

2.5 退熱機制及配伍規律解析 解表散熱為小柴胡顆粒的主效應[30]，有必要進一步闡釋其退熱機制及配伍規律。病毒、細菌等發熱激活物進入體內后，可激活產致熱原細胞，促使其釋放IL-1、TNF、IFN、MIP-1、IL-6等內生致熱原，誘導體溫調節中樞釋放PGE2、cAMP等發熱介質，導致調節性體溫升高，從而引起機體各組織器官功能和物質改變。前期工作發現，TNF信號通路為小柴胡顆粒的關鍵作用通路，該通路參與調控細胞存活、凋亡和分化，與抗病毒、炎癥、免疫等生物學功能密切相關[31]，參與機體發熱病程[32]。小柴胡顆粒各味藥材的靶點標記情況見圖6，靶點顏色深淺代表作用藥材數量多少，靶點下方柱形顏色代表作用藥材種類。

圖6 小柴胡顆粒各藥材在TNF信號通路中的作用靶點圖

小柴胡顆粒7味藥材共富集得到TNF信號通路中27個靶點，其中全部7種藥材共同作用的核心靶點有5個：核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、胱天蛋白酶3(CASP3)。NF-κB是對有害細胞刺激的第一反應者，可激活多種細胞因子，參與抗病毒、炎癥反應等生理過程[33-34]；AP-1為JUN、FOS復合體，影響細胞分化增殖，參與免疫、外界刺激應激等，可調控促炎因子表達[35]；PTGS2，即COX-2，是發熱介質PGE2合成的主要限速酶，直接參與了發熱、疼痛、炎癥反應[36]；MMP9參與細胞重構、組織修復，可通過降解細胞外基質和基底膜，調控細胞因子及趨化因子的活性，促進病毒擴散并參與病毒感染引起的免疫反應[37]，與發熱、咳嗽、肺炎病程相關；CASP3參與細胞凋亡，影響病毒擴散、增殖與組織修復[38]。全部7味藥材可共同作用于上述5個核心靶點，從凋亡、炎癥、免疫、發熱介質多靶點多層面發揮退熱功效。

在藥材配伍方面，君藥柴胡與絕大部分靶點密切相關(24個)，發揮主導作用；臣藥黃芩除5個核心靶點外，還作用于白細胞趨化因子CCL2、促炎因子IL-6等，增強了柴胡在調控免疫、抑制炎癥、退熱方面的作用；佐藥生姜、半夏、大棗、黨參合用，加強了柴胡在炎癥因子、趨化因子、PTGS2等方面的作用，有助于縮短病程；使藥甘草參與26個靶點相關，可能起到調和諸藥的作用。由此可知，小柴胡顆粒7味藥材通過組方配伍，能夠提高機體免疫力、抑制炎癥、調節體溫，加速病原體清除，縮短咳嗽、發熱病程。

小柴胡顆粒發揮退熱療效的潛在機制如下：(1)調節TNF信號通路上游基因：①作用于IKK α和β催化亞基，調節NF-κB激活狀態，NF-κB進一步調控細胞凋亡、炎癥一系列活動；②通過JNK、p38、ERK 3個途徑調節MAPK通路；③作用于AP-1復合物，調控機體應對外界刺激時的細胞進程；④作用于CASP家族，參與細胞凋亡。(2)調節TNF信號通路下游基因：①作用于促炎趨化因子，影響白細胞趨化及活性、病原體吞噬等免疫過程；②作用于內生致熱原，IL-1和IL-6、IFN-γ，直接調控發熱介質釋放；③作用于基質金屬蛋白酶，參與細胞重構、組織修復；④作用于細胞黏附因子，參與免疫細胞的黏附和遷移；⑤作用于產生發熱介質的關鍵酶PTGS2，直接參與體溫調控。

3 小結及展望

本研究基于網絡藥理學技術，通過單成分濃度疊加、單靶點作用疊加、多靶點協同作用等方面，科學解析了小柴胡顆粒的組方配伍規律。君藥柴胡發揮主導地位，作用于抗病毒、退熱、免疫、炎癥等相關通路及靶點；臣藥黃芩可加強柴胡作用，同時增加抗菌功效；佐藥黨參、大棗通過作用于內分泌、松弛素、心血管相關通路及靶點，影響胃腸道、肝臟、血管內皮功能，發揮益氣健脾，養血生津的功效；佐藥半夏、生姜通過控神經活性、神經傳導、激素分泌，發揮和胃降逆止嘔、抗抑郁的功效；使藥甘草具有調和諸藥的作用。同時，本研究發現小柴胡顆粒7味藥材共同作用的5個核心靶點，對其退熱療效及藥材配伍具有重要作用。本研究為小柴胡顆粒科學內涵的挖掘提供了依據，為后續作用機制與靶點的確證提供了參考。