HPLC法測定斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量

林凡友，孫永喜，陳仁燕

(翔宇藥業股份有限公司，山東 臨沂 276023)

斷血流是一種民間傳統用藥，含有多種化學成分，具有止血、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎等藥理作用，臨床上主要應用于治療各種出血癥[1-2]。斷血流口服液是由斷血流藥材經提取濃縮等工藝制成的口服液，具有涼血止血的功效。適用于血熱妄行的出血證候，用于功能性子宮出血，產后出血，子宮肌瘤出血，單純性紫癜，原發性血小板減少性紫癜系血熱妄行者[3]。目前現行標準是原國家食品藥品監督管理總局發布的國家藥品標準(WS-546(X-079)-2000-2016Z)，其中斷血流口服液含量檢測方法為薄層掃描法，目前廣泛用于測定斷血流皂苷含量的方法有高效液相色譜法[4-5]、紫外分光光度計法[6]，為提高斷血流口服液含量檢測的準確性，試驗制定了高效液相色譜(HPLC)法檢測斷血流口服液中的斷血流皂苷A，并對該含量測定方法進行了方法學驗證。試驗表明，該方法簡單，可以有效地檢測斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量，準確地控制制劑有效成分，保證產品質量。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測器，型號：G1314F，美國安捷倫公司)；AUW220D型電子天平。斷血流皂苷A對照品(批號：110782-200602)來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，來源于美國天地有限公司；水為純化水；其他試劑均為分析純。斷血流口服液樣品來源于翔宇藥業股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(75∶25)，檢測波長250 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。理論板數按斷血流皂苷A峰計算應不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取斷血流口服液適量(批號：200401)，精密量取本品1 mL，加水24 mL，搖勻，置分液漏斗中，加水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液30 mL洗滌，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，取正丁醇蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 稱取五氧化二磷減壓干燥器內干燥12 h的斷血流皂苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含500 μg的溶液，即得對照品貯備溶液，精密吸取對照品貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液制備 取不含斷血流藥材的陰性樣品適量，同供試品溶液制備處理方法，配制成陰性供試品溶液。

2.3 專屬性試驗 分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各20 μL，用高效液相色譜儀測定，如圖1。在該色譜條件下陰性樣品對樣品峰沒有干擾；主峰保留時間在20 min左右，理論板數按斷血流皂苷A峰計算大于3 000，說明該方法專屬性良好。

圖1 斷血流口服液專屬性試驗HPLC色譜圖

2.4 線性試驗 精密吸取對照品儲備液適量分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋制成濃度分別為2.21、6.63、8.84、11.05、16.58、22.1 μg·mL-1的溶液，分別作為20%、60%、80%、100%、150%、200%的線性溶液，依法測定斷血流皂苷A的含量。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。由試驗結果可知，斷血流皂苷A含量在2.21～22.1 μg·mL-1的濃度范圍內，線性方程為Y=32.493X+1.241 3，r=0.999 9(n=6)，峰面積和濃度均呈現良好線性關系，結果見圖2。

圖2 斷血流皂苷A含量測定線性關系標準曲線圖

2.5 系統精密度試驗 取對照品溶液，重復測6次，并記錄色譜圖。結果表明：峰面積的RSD值為0.27%，表明該方法的系統精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密量取一批樣品6份，按供試品制備方法制備供試品溶液，依法測定，計算含量為0.816 mg·mL-1，含量RSD為1.83%，表明該方法的重復性較好。

2.7 穩定性試驗 將供試品溶液于室溫條件下放置12 h，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h測定。結果表明，在室溫條件下放置12 h內，測得供試品峰面積的相對標準偏差為0.40%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取斷血流口服液樣品(批號：200401，斷血流皂苷A含量為0.816 mg·mL-1)適量，每個容量瓶中分別精密加入0.5 mL，共9份，分別加入適量對照品溶液與供試品中待測成分含量之比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1，依法測定，如表1。由試驗結果可知，含量測定各濃度下回收率在98.49%～101.51%范圍內，平均值為99.66%，RSD為1.12%，表明該方法回收率良好。

表1 斷血流口服液含量測定回收率試驗結果(n=9)

2.9 耐用性試驗 分別考察了標準色譜條件及柱溫(20、30 ℃)、流速(0.9、1.1 mL·min-1)、 流動相比例(73∶27～77∶23)、不同品牌柱子(迪瓦、月旭、熱電)條件下，分別測定含量。結果表明，在柱溫、色譜柱、流動相比例及流速等變動因素有微小變化

時，斷血流皂苷A含量RSD為1.13%，斷血流皂苷A含量測定試驗結果均基本沒有變化，表明該方法的耐用性良好。

2.10 樣品含量測定 取3批斷血流口服液，依法測定斷血流皂苷A含量，結果如表2所示。

表2 斷血流口服液樣品中斷血流皂苷A含量測定結果

3 討論

3.1 流動相考察 考察了流動相甲醇-水(71∶29)[7]、甲醇-水(75∶25)[8-9]、甲醇-0.5%磷酸(75∶25)[10]，經研究發現，流動相為甲醇-0.5%磷酸(75∶25)時，在峰前有個小鼓包且基線不平，流動相為甲醇-水(71∶29)時，斷血流皂苷A含量較流動相為甲醇-水(75∶25)時低，流動相為甲醇-水(75∶25)時斷血流皂苷A峰對稱性好，基線平，雜峰少，能準確檢測斷血流皂苷A色譜峰。

3.2 波長的選擇 通過對斷血流皂苷A對照品溶液的紫外吸收全波長掃描，確定在250 nm處，斷血流皂苷A有最大吸收，故選用250 nm作為高效液相色譜檢測波長。

斷血流口服液是純中藥制劑，安全有效、副作用小，其所含成分復雜，經藥理和臨床試驗證明，其皂苷類成分對于止血具有治療出血的作用，因此選擇檢測斷血流皂苷A來控制斷血流口服液有效成分及樣品質量[11]。本文采用高效液相色譜法測定斷血流口服液中的斷血流皂苷A的含量，操作簡單，含量準確，靈敏度高，耐用性強，能準確控制藥物的質量，可以作為檢測斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量。